增强胞苷生产的方法及应用技术

本发明专利技术公开了增强胞苷生产的方法及应用，属于基因工程和微生物工程领域。本发明专利技术通过敲除胞苷脱氨酶基因cdd、尿苷激酶基因udk、嘧啶特异性核糖核苷水解酶基因rihB、核苷酸5

【技术实现步骤摘要】
增强胞苷生产的方法及应用


[0001]本专利技术涉及增强胞苷生产的方法及应用，属于基因工程和微生物工程领域。

技术介绍

[0002]1‑
β
‑
D
‑
呋喃核苷胞嘧啶(1
‑
beta
‑
ribofuranosylcytosine)又名胞嘧啶核苷(cytosine nucleoside)、胞苷(cytidine)。胞苷是由胞嘧啶的N
‑
1与D
‑
核糖的C
‑
1通过β糖苷键相连接形成的化合物。胞苷存在于一切生物体内，是RNA的组成部分。胞苷最重要的工业用途是作为化学合成抗病毒、抗肿瘤药物的原料。许多胞苷结构类似物，都具有干扰细胞RNA合成的作用。基于这一原理，已开发出了多种胞苷类似物，用于治疗病毒感染和肿瘤，其中许多药物被作为临床特效药和首选药物而广泛使用。例如：扎西他滨(2'，3'
‑
双脱氧胞嘧啶核苷)，能够竞争性的抑制逆转录酶活性，被广泛用于治疗HIV感染和其它逆转录病毒感染。卡培他滨(5'
‑
脱氧
‑5‑
氟
‑
N
‑
[(戊氧基)羰基]胞苷)，也是一种胞苷类似物，在临床上用于治疗肠癌、胃癌、肝癌和乳腺癌等多种肿瘤。这些胞苷结构类似物都是重要的临床药物，都是以胞苷为原料，通过化学合成生产。因此，胞苷是重要的医药中间体。
[0003]目前为止，胞苷的工业生产方法包括RNA水解法、化学合成法和微生物发酵法三种。RNA水解法生产胞苷虽然有技术简单、容易操作和控制等优点，但是对原料要求较高，工艺过程复杂，产品收率低，生产成本过高，目前已基本被其它方法所替代。已开发出了数十种化学合成法生产胞苷的工艺技术，最新的胞苷合成工艺是用双对硝基酚磷酸酯为催化剂，催化N4
‑
乙酰胞嘧啶和四
‑
O
‑
乙酰基
‑
β
‑
D
‑
呋喃核糖反应，经脱除乙酰基，生成胞苷。化学合成法生产胞苷的技术发展至今，显著降低了胞苷的价格。但是，化学合成法固有的反应路线长、反应条件苛刻、催化剂价格昂贵、副产品多以及潜在的环境污染等特点所限，进一步降低生产成本几乎不可能。由于胞苷生产成本的问题，限制了其在医药领域和其它用途的应用。
[0004]微生物发酵法生产胞苷包括添加前体物发酵法和直接发酵法。添加前体物发酵法生产胞苷主要是利用胞苷合成的补救途径，胞苷合成的补救途径是指培养基中补加的尿嘧啶与微生物细胞内的5
‑
磷酸核糖焦磷酸(PRPP)，在尿嘧啶核糖磷酸转移酶(pyrR/upp)的催化下直接生成UMP，然后经过UDP、UTP、CTP生成胞苷。直接发酵法胞苷，主要是利用微生物的UMP的“从无到有”生成UMP，然后再经UDP、UTP、CTP生成胞苷。利用微生物的补救途径发酵生产胞苷，需要尿嘧啶作为发酵的前体物，造成原料成本高，生产效率低，不是技术发展的方向。而直接发酵法可通过微生物遗传育种技术，选育高产胞苷的发酵菌种，以葡萄糖为主要原料，在温和的条件下，经过相对简单的工艺，生产高质量的胞苷。直接发酵法能够进一步降低胞苷的生产成本，生产过程相对环境友好，技术提升空间较大。
[0005]CN106754602A披露了一种生产胞苷的重组微生物及生产胞苷的方法，敲除了胞苷脱氨酶、核糖核苷水解酶、胞苷/尿苷激酶、核苷转运蛋白，同时过量表达了胞苷三磷酸焦磷酸化酶、胞苷单磷酸磷酸化酶，解除嘧啶核苷途径的反馈抑制，构建了一株重组大肠杆菌，其在5L发酵罐可达20g/L的胞苷生产水平。但该方法构建的菌株在发酵时需要添加抗生素，
且在发酵生产胞苷时，需要添加诱导剂IPTG，且产量不高。该诱导剂和抗生素价格昂贵且对细胞有毒性，同时如果胞苷的积累浓度进一步获得提高，将进一步促进其工业化生产。

技术实现思路

[0006]本专利技术要解决的技术问题是现有技术中缺少可高产胞苷的重组菌株，特别是缺少在不添加诱导剂和抗生素的条件下高产胞苷的重组菌株。
[0007]本专利技术提供了一种重组大肠杆菌，敲除了基因组上的胞苷脱氨酶基因cdd、尿苷激酶基因udk、嘧啶特异性核糖核苷水解酶基因rihB、核苷酸5
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单磷酸核苷酶基因ppnN、丙酮酸氧化酶基因poxB和核糖核苷三磷酸还原酶基因nrdD，并整合表达5
’‑
CTP二磷酸水解酶和/或乳清酸磷酸核糖转移酶。
[0008]在一种实施方式中，所述胞苷脱氨酶基因cdd的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述尿苷激酶基因udk的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述嘧啶特异性核糖核苷水解酶基因rihB的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述核苷酸5
’‑
单磷酸核苷酶基因ppnN的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0009]在一种实施方式中，所述5
’‑
CTP二磷酸水解酶具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
[0010]在一种实施方式中，所述乳清酸磷酸核糖转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.10所示。
[0011]在一种实施方式中，在umpH位点整合5
’‑
CTP二磷酸水解酶基因；所述5
’‑
CTP二磷酸水解酶的基因序列如SEQ ID NO.5所示。
[0012]在一种实施方式中，在umpH位点整合乳清酸磷酸核糖转移酶基因pyrE和/或pyrE/K26H；所述乳清酸磷酸核糖转移酶基因pyrE的基因序列如SEQ ID NO.7所示；所述pyrE/K26H的基因序列如SEQ ID NO.9所示。
[0013]在一种实施方式中，所述丙酮酸氧化酶基因poxB的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述的核糖核苷三磷酸还原酶基因nrdD如SEQ ID NO.18。
[0014]在一种实施方式中，所述的重组大肠杆菌在丙酮酸氧化酶基因poxB所在位置还整合表达了尿苷酸激酶突变体基因PyrH(R92G/D93G)。
[0015]在一种实施方式中，所述尿苷酸激酶突变体PyrH(R92G/D93G)具有SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。
[0016]在一种实施方式中，所述的重组大肠杆菌在核糖核苷三磷酸还原酶基因nrdD所在位置整合表达磷酸核糖焦磷酸合成酶基因prs、葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶基因zwf和6
‑
磷酸葡糖酸脱氢酶基因gnd。
[0017]在一种实施方式中，所述磷酸核糖焦磷酸合成酶基因prs、葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶基因zwf和6
‑
磷酸葡糖酸脱氢酶基因gnd采用串联表达；所述prs与zwf之间含有RBS序列AGGA；所述zwf与gnd之间含有RB本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组大肠杆菌，敲除了基因组上的胞苷脱氨酶基因cdd、尿苷激酶基因udk、嘧啶特异性核糖核苷水解酶基因rihB、核苷酸5
’‑
单磷酸核苷酶基因ppnN、丙酮酸氧化酶基因poxB和核糖核苷三磷酸还原酶基因nrdD，并整合表达5
’‑
CTP二磷酸水解酶和/或乳清酸磷酸核糖转移酶。2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述5
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CTP二磷酸水解酶具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；所述乳清酸磷酸核糖转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.10所示。3.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，在umpH位点整合5
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CTP二磷酸水解酶和/或乳清酸磷酸核糖转移酶的编码基因。4.根据权利要求3所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述5
’‑
CTP二磷酸水解酶的基因序列如SEQ ID NO.5所示；所述乳清酸磷酸核糖转移酶的基因序列如SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.9所示。5.根据权利要求1～4任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，在丙酮酸氧化酶基因poxB所在位置整合表达尿苷酸激酶突变体；所述尿苷酸激酶突变体具有SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列。6.根据权利要求1～5任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌在核糖核苷三磷酸还原酶基因n...

【专利技术属性】
技术研发人员：张玮琪，张剑，
申请(专利权)人：江苏香地化学有限公司，
类型：发明
国别省市：