一种用于生物合成胆红素的重组大肠杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于生物合成胆红素的重组大肠杆菌及其应用，所述重组大肠杆菌同时表达沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)来源的5

【技术实现步骤摘要】
一种用于生物合成胆红素的重组大肠杆菌及其应用
(一)

[0001]本专利技术属于生物合成
，具体涉及一种用于生物合成胆红素的重组大肠杆菌及其应用。
(二)
技术介绍

[0002]胆红素(bilirubin，CAS：635
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65
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4)是在一些生物体内，由血红素降解产生的一类橙黄色胆色素。在脊椎动物体中，衰老死亡的红细胞释放出血红素，血红素在血红素加氧酶(heme oxygenase，简称HO，有HO1、HO2和HO3三种类型，其中HO1主要酶)的作用下，在α
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亚甲基桥处开环生成胆绿素，胆绿素又在胆绿素还原酶(biliverdin reductase，BVR)的作用下，进一步还原生成胆红素。
[0003]过去，胆红素都被认为是一种对神经系统有害无利的代谢废物，但是近年来，随着对胆红素的系统研究不断深入，人们对胆红素有了更多的认识，发现胆红素具有一系列重要的生理作用，包括抗氧化活性、抗炎、免疫调节、抗病毒、抗增殖活性等；在中医方面，胆红素具有镇静、解热、降压、抗惊厥等作用。
[0004]胆红素是天然牛黄的主要成分，其含量是评价牛黄品质优劣的重要依据。
[0005]目前，胆红素主要是从动物胆汁中提取，但胆汁中天然胆红素含量相当低。
[0006]近些年来，国内围绕开发非动物胆汁来源的胆红素生产方法开展了较多的研究，如曹晖从牛的肝脏和脾脏中提取含HO1和BVR的粗酶液，以血红素为原料酶解制备胆红素，转化率大约为41.7％(底物浓度未知)，该方法的不足是牛肝或脾消耗量非常大，使用1kg的牛肝脏或脾脏只能制备1.92g的胆红素[CN 200910021339.9]；张琦利用固定化重组大肠杆菌表达的HO和BVR，以血红素为底物，在辅酶NADPH参与下生产胆红素，虽然转化率达到80％，但血红素浓度仅为100μmol/L(0.0617g/L)[CN 201210395683.6]，较低的底物浓度不可能获得较高的产率，而且转化反应需要外加价格较高的NADPH；朱俊歌等构建同时表达葡萄糖脱氢酶(GDH)、HO1和BVR的重组大肠杆菌，以外源血红素为底物，生物转化法合成胆红素[CN 202210568351.7]，在该专利实施例3中，10mL的转化体系中加入0.01g羟高铁血红素，经重组大肠杆菌转化后，得到了纯度98.3％的胆红素0.85g，产物是底物质量的85倍，显然这一结果是不可能实现。实际上，由于血红素进入大肠杆菌胞内存在跨膜障碍，这种方法也很难实现高效的转化。
[0007]大肠杆菌细胞自身能够合成血红素，当大肠杆菌表达外源HO1和BVR时，就可以将自身的血红素转化为胆红素。由于大肠杆菌细胞内血红素合成浓度低，这个方法合成胆红素的产率自然不会很高，所以要想表达HO1和BVR的基因重组大肠杆菌能高效合成胆红素，就必须让大肠杆菌合成较多的血红素。
[0008]大肠杆菌细胞内血红素的合成主要受前体物质5
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氨基乙酰丙酸(ALA)的限制(代谢途径见图1，虚线框内是原大肠杆菌细胞内没有的途径)，如果强化大肠杆菌胞内ALA的合成，就能促进血红素的合成。大肠杆菌细胞内合成的ALA的途径相对复杂，涉及多个酶促反应，而且途径中的谷氨酰
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tRNA还原酶的酶活受下游血红素的反馈抑制。所以，如果能够增
强大肠杆菌细胞中ALA的合成水平，从而促进血红素的合成，继而就能提高胆红素的合成产率，为此，本专利技术在大肠杆菌中表达外源HO1和BVR的同时，也表达5
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氨基乙酰丙酸合成酶(ALAS)，提高ALA的合成水平，继而实现高产率的合成胆红素。
(三)
技术实现思路

[0009]本专利技术提供了一种用于生物合成胆红素的重组大肠杆菌及其应用，利用基因工程技术构建了同时表达ALAS、HO1和BVR三种酶(图1中的虚线框内的3个酶)的基因重组大肠杆菌，在不外加血红素的条件下，就能较高产率地生物合成胆红素，开辟了一种非动物胆汁来源的胆红素生物合成方法，生产工艺具有高效、绿色环保等优点。
[0010]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：
[0011]本专利技术提供一种用于生物合成胆红素的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌同时表达沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)来源的5
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氨基乙酰丙酸合成酶(5
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aminolevulinic acid synthetase，ALAS)、集胞藻(Synechocystis sp.)来源的血红素加氧酶(HO1)和胆绿素还原酶(BVR)。
[0012]优选的，所述5
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氨基乙酰丙酸合成酶编辑基因hemO核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述血红素加氧酶编码基因ho1核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述胆绿素还原酶编码基因bvr核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
[0013]优选的，所述的重组大肠杆菌按以下步骤构建：
[0014](1)依据NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库提供的沼泽红假单胞菌(R.palustris)DSM123的ALAS基因(hemO，Accession：JQ048722.1)、集胞藻(Synechocystissp.)PCC 6803的HO1基因(ho1，Accession：CP012832)和BVR基因(bvr，Accession：CP012832)，经大肠杆菌偏好密码子优化后，并分别在3个基因序列的两端引入限制性内切酶位点，化学合成基因的DNA序列，合成的hemO、ho1和bvr序列分别见SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3；
[0015](2)合成的hemO序列和表达质粒载体pCDFDuet
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1，分别经限制性内切酶HindⅢ和Pst I双酶切后，构建成重组质粒pCDFDuet
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hemO；合成的ho1序列和质粒载体pETDuet
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1，分别经限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切，构建成重组质粒pETDuet
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ho1，bvr序列和重组质粒pETDuet
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ho1，分别经限制性内切酶EcoR I和SaI I双酶切后，构建成重组质粒pETDuet
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ho1
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bvr；
[0016](3)将步骤(2)构建的质粒pCDFDuet
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hemO和pETDuet
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ho1
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bvr，热激法同时转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，筛选阳性转化子，经菌落PCR鉴定，SDS
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PAGE验证，获得的能够同时表达ALAS、HO1和BVR三种酶的重组大肠杆菌，该菌株编名为大肠杆菌zjut
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brn。
[0017]本专利技术还涉及所述重组大肠杆菌在生本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于生物合成胆红素的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌同时表达沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)来源的5
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氨基乙酰丙酸合成酶、集胞藻(Synechocystis sp.)来源的血红素加氧酶和胆绿素还原酶。2.如权利要求1所述用于生物合成胆红素的重组大肠杆菌，其特征在于，所述5
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氨基乙酰丙酸合成酶编辑基因hemO核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述血红素加氧酶编码基因ho1核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述胆绿素还原酶编码基因bvr核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。3.如权利要求1所述用于生物合成胆红素的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的重组大肠杆菌按以下步骤构建：(1)将5
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氨基乙酰丙酸合成酶、血红素加氧酶和胆绿素还原酶的编码基因，经大肠杆菌偏好密码子优化后，并分别在3个基因序列的两端引入限制性内切酶位点，化学合成基因的DNA序列，获得hemO序列、ho1序列、bvr序列；(2)合成的hemO序列和表达质粒载体pCDFDuet
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1，分别经限制性内切酶HindⅢ和Pst I双酶切后，构建成重组质粒pCDFDuet
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hemO；合成的ho1序列和质粒载体pETDuet
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1，分别经限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切，构建成重组质粒pETDuet
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ho1，bvr序列和重组质粒pETDuet
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ho1，分别经限制性内切酶EcoR I和SaI I双酶切后，构建成重组质粒pETDuet
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ho1
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bvr；(3)将步骤(2)构建的质粒pCDFDuet
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hemO和pETDuet
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ho1
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bvr，热激法同时转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，筛选阳性转化子，经菌落PCR鉴定，SDS
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PAGE验证，获得的能够同时表达三种酶的重组大肠杆菌。4.一种权利要求1所述重组大肠杆菌在生物合成胆红素中的应用。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的应用的方法为：将重组大肠杆菌接种至含50μg/mL链霉素和100μg/mL氨苄青霉素的TB培养基中，于35
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37℃、180
–
220r/min摇床中培养2.0
–
3.0h至OD
600
＝0.8
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1.2，加入终浓度为0.05
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0.1mmol/L的IPTG，或终浓度为2
–
4g/L的乳糖作为诱导剂，在30
–
32℃、180
–
220r/min的摇床中诱导表达培养24
–
32h至OD
600

【专利技术属性】
技术研发人员：梅建凤，季军情，陈乐生，应国清，易喻，
申请(专利权)人：上海和不同科技有限公司，
类型：发明
国别省市：