一种高产N-乙酰神经氨酸的重组大肠杆菌的构建方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种高产N

【技术实现步骤摘要】
一种高产N
‑
乙酰神经氨酸的重组大肠杆菌的构建方法及应用


[0001]本专利技术涉及一种高产N
‑
乙酰神经氨酸的重组大肠杆菌的构建方法及应用，属于微生物基因工程领域。

技术介绍

[0002]唾液酸(SA)是一类具有9碳骨架的α
‑
酮酸糖家族，广泛存在于动物组织，特别是脊椎动物的细胞表面糖链和糖链的末端成分中，参与许多生物学事件，包括细胞识别、通讯、黏附和聚集，在免疫识别和受精中发挥关键作用，还介导病毒入侵和癌症转移。N
‑
乙酰神经氨酸(NeuAc)是最常见的唾液酸分子之一，并且通常作为其他唾液酸的生物合成前体。N
‑
乙酰神经氨酸天然存在于许多生物体，包括病毒、细菌、真菌、原生动物和高等动物。在人类细胞中，N
‑
乙酰神经氨酸主要与蛋白质、脂质和寡糖结合，形成复杂的唾液酸化结构。此外，N
‑
乙酰神经氨酸是唾液酸化母乳寡糖(HMOs)的关键单糖，大约14％
‑
33％的母乳寡糖与N
‑
乙酰神经氨酸交联。N
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乙酰神经氨酸在促进大脑发育和认知、抗粘附、抗菌、抗病毒、免疫调节、心血管保护和抗氧化等方面具有重要作用，已被美国FDA、欧盟和中国食品药品监督管理局批准用作一种新型食品原料。因此，N
‑
乙酰神经氨酸在制药、化妆品和食品行业具有巨大的商业潜力。
[0003]N
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乙酰神经氨酸可以通过从自然资源中提取或通过化学法合成，但这些方法存在生产过程复杂、生产效率低、立体选择性差、环境污染大和成本高等缺点。目前，N
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乙酰神经氨酸主要通过全细胞催化生产，依赖于所需酶的高效表达纯化，并以较昂贵的N
‑
乙酰葡糖胺(GlcNAc)和丙酮酸为底物，因此不适于大规模生产。基于代谢工程策略的细胞工厂化方法以甘油和葡萄糖等更廉价的物质为底物从头合成N
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乙酰神经氨酸，容易放大生产，是一种更有前景的高效生产策略。大肠杆菌的遗传背景清晰，能高效表达外源基因，相关技术操作简单，培养周期短，是最常被用于工程化生产化学品的模式底盘微生物之一。目前，细胞工厂法生产N
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乙酰神经氨酸一般通过过表达外源N
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乙酰葡萄糖胺
‑2‑
异构酶AGE以合成关键前体N
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乙酰甘露糖胺(ManNAc)，但AGE催化的反应过程存在着一定的热力学瓶颈，且代谢流强度不能满足现阶段大规模工业化生产的需求。因此，寻找合适大肠杆菌的N
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乙酰神经氨酸合成途径并优化关键途径酶表达水平是有效的解决办法之一。

技术实现思路

[0004]针对目前已报道的合成途径不能满足N
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乙酰神经氨酸工业化生产需求的问题，本专利技术提供了一种高产N
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乙酰神经氨酸的重组大肠杆菌及其构建方法。
[0005]本专利技术构建的重组大肠杆菌是以大肠杆菌BL21(DE3)为出发菌株，通过在基因组上敲除竞争途径基因N
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乙酰神经氨酸醛缩酶基因nanA，唾液酸转运体基因nanT，N
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乙酰甘露糖胺激酶基因nanK和氨基葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氨酶基因nagB，并游离表达外源的UDP
‑
N
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乙酰甘露糖胺差向异构酶基因neuC和N
‑
乙酰神经氨酸合酶基因neuB，并通过同源过表达UDP
‑
GlcNAc合成途径基因glmM，glmU和GlmS突变体基因glmS*增强UDP
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GlcNAc供应，而获得的一
种高产N
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乙酰神经氨酸的重组大肠杆菌，具备工业化应用的潜力。
[0006]本专利技术的第一个目的是提供一种可高效生产N
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乙酰神经氨酸的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌敲除了大肠杆菌基因组上的N
‑
乙酰神经氨酸醛缩酶基因nanA(Gene ID:947742)，唾液酸转运体基因nanT(Gene ID:47740)，N
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乙酰甘露糖胺激酶基因nanK(Gene ID:947757)以及葡萄糖胺
‑6‑
磷酸脱氨酶基因nagB(Gene ID:45290)，表达了UDP
‑
N
‑
乙酰甘露糖胺差向异构酶基因neuC、N
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乙酰神经氨酸合酶基因neuB，并过表达了内源基因glmM(Gene ID:947692)，glmU(Gene ID:948246)和氨基葡萄糖
‑6‑
磷酸合成酶GlmS突变体基因glmS*。
[0007]在一种实施方式中，所述neuC基因来源于Neisseria meningitidis、Campylobacterjejuni或能表达相同功能酶的微生物，所述neuB基因来源于Neisseria meningitidis、Campylobacterjejuni或能表达相同功能酶的微生物。优选的，所述基因neuC的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述基因neuB的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0008]在一种实施方式中，所述内源基因glmM的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，基因glmU的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0009]在一种实施方式中，所述氨基葡萄糖
‑6‑
磷酸合成酶GlmS突变体编码基因glmS*的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
[0010]在一种实施方式中，利用pRSFDuet
‑
1载体表达基因glmM，glmU和glmS*。
[0011]在一种实施方式中，利用Duet
‑
1系列载体表达基因neuC、neuB。优选地，所述Duet
‑
1载体为pCOLADuet
‑
1。
[0012]在一种实施方式中，Neisseria meningitidis来源的基因neuB和neuC串联表达的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，Campylobacterjejuni来源的基因neuB和neuC串联表达的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0013]在一种实施方式中，所述大肠杆菌包括但不限于大肠杆菌BL21(DE3)。
[0014]本专利技术的第二个目的是提供了一种生产N
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乙酰神经氨酸的方法，所述方法是利用所述重组大肠杆菌发酵生产N
‑
乙酰神经氨酸。
[0015]在一种实施方式中，所述方法为在含有20～40g/L甘油的培养基中，利用所述重组大肠杆菌，在35～38℃发酵培养至OD
600
0.6～0.8后，22～25℃诱导培养至少72h。
[0016本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高产N
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乙酰神经氨酸的重组大肠杆菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，敲除基因组上的N
‑
乙酰神经氨酸醛缩酶基因nanA，唾液酸转运体基因nanT，N
‑
乙酰甘露糖胺激酶基因nanK以及氨基葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氨酶基因nagB，游离表达UDP
‑
N
‑
乙酰甘露糖胺差向异构酶基因neuC，N
‑
乙酰神经氨酸合酶基因neuB，过表达内源基因glmM，glmU和氨基葡萄糖
‑6‑
磷酸合成酶GlmS突变体基因glmS*；所述neuC基因来源于Neisseriameningitidis、Campylobacterjejuni或能表达相同功能酶的微生物，所述neuB基因来源于Neisseriameningitidis、Campylobacterjejuni或能表达相同功能酶的微生物。2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述N
‑
乙酰神经氨酸醛缩酶基因nanA的Gene ID为947742；唾液酸转运体基因nanT的GeneID为947740；所述N
‑
乙酰甘露糖胺激酶基因nanK的Gene ID为947757；所述氨基葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氨酶基因nagB的GeneID为945290。3.根据权利要求1～2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述基因neuC的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述基因neuB的...

【专利技术属性】
技术研发人员：沐万孟，朱莺莺，赵明利，张文立，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：