一种表达猪塞内卡病毒重组蛋白的枯草芽孢杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种用于表达猪塞内卡病毒重组蛋白的枯草芽孢杆菌及其在制备猪塞内卡病毒重组蛋白疫苗中的应用。所述的VP2蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3。本发明专利技术所构建的枯草芽孢杆菌表达系统安全无毒，能够高效分泌猪塞内卡病毒重组蛋白。本发明专利技术使用的猪塞内卡重组蛋白是通过转入pHT43

【技术实现步骤摘要】
一种表达猪塞内卡病毒重组蛋白的枯草芽孢杆菌及其应用


[0001]本专利技术属于生物疫苗制品
，具体涉及一种表达猪塞内卡病毒重组蛋白的枯草芽孢杆菌及其在制备疫苗中的应用。

技术介绍

[0002]猪塞内卡病毒(Seneca virus，SVA)是近几年新发现的一种动物疫病病毒，该病毒能够引起不同年龄阶段的猪产生水疱性病变、腹泻、跛行，甚至可引起新生仔猪大量死亡。猪塞内卡病毒SVA导致的病症在临床症状上与猪口蹄疫、猪水疱病极为相似，而预防猪塞内卡病毒感染对控制猪水疱性疾病具有重要意义，疫苗是预防猪塞内卡病毒感染的最有效措施。
[0003]VP2蛋白是SVA的结构蛋白之一，具有较强的免疫原性，是制备猪塞内卡病毒亚单位疫苗理想的候选靶标。目前使用的大肠杆菌表达系统进行VP2蛋白表达时主要以包涵体形式的蛋白出现，可溶性表达产量低。包涵体形式的蛋白作为疫苗抗原来使用效果不佳，而且需要多道工艺对蛋白进行纯化，在生产过程中大肠杆菌会产生大量内毒素，处理方法复杂，不能满足实际生产的需求。
[0004]枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种分布广泛、需氧并产芽孢的革兰氏阳性杆菌，遗传背景清晰，无致病性，已被美国食品药品监督管理局(FDA)评为生物安全菌株(GRAS)。改造后的枯草芽孢杆菌WB800N已经解决野生型菌株Bacillus subtilis168在生长过程中降解表达产物的问题，成为猪塞内卡病毒VP2蛋白的理想表达宿主。
[0005]基于上述考虑，本专利技术人通过构建表达猪塞内卡病毒VP2蛋白的重组枯草芽孢杆菌，解决VP2蛋白以包涵体形式出现的问题。猪塞内卡病毒VP2蛋白高效地分泌到胞外，极大地简化蛋白纯化流程、缩短生产周期，但我们又发现VP2蛋白表达量不能满足大规模生产的需要。在此基础上，本专利技术人通过改造VP2蛋白，筛选获得高水平表达重组蛋白的枯草芽孢杆菌，并且增强重组蛋白的免疫原性。

技术实现思路

[0006]为解决现有技术存在的问题，本专利技术的目的是提供一种用于表达猪塞内卡病毒重组蛋白的枯草芽孢杆菌及其在制备猪塞内卡病毒重组蛋白疫苗中的应用。
[0007]本专利技术首先提供一种重组枯草芽孢杆菌工程菌，所述的重组枯草芽孢杆菌工程菌中包含有重组表达猪塞内卡病毒VP2蛋白的表达载体；
[0008]所述的猪塞内卡病毒VP2蛋白，其一种具体的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：2；
[0009]在保留VP2蛋白的免疫原性的基础上，为了提高VP2蛋白的表达效率，本专利技术还提供一种重组多肽，所述的重组多肽是将VP2蛋白截短体通过Linker连接组成，其中重组蛋白的一种氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
[0010]所述的表达载体，作为一个实施例的具体记载，为pHT43
‑
His
‑
rVP2高效表达载体。
[0011]本专利技术还提供一种猪塞内卡病毒重组蛋白疫苗，其包含猪塞内卡病毒重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
[0012]作为优选，所述猪塞内卡病毒重组蛋白为应用本专利技术所述的重组枯草芽孢杆菌表达得到。
[0013]本专利技术所构建的枯草芽孢杆菌表达系统安全无毒，能够高效分泌猪塞内卡病毒重组蛋白。本专利技术使用的猪塞内卡重组蛋白是通过转入pHT43
‑
His
‑
rVP2高效表达载体的枯草芽孢杆菌表达获得，所述pHT43
‑
His
‑
rVP2高效表达载体通过同源重组技术获得，不仅实现了猪塞内卡病毒重组蛋白的高水平表达，而且能够高效分泌到细胞外，极大地简化了重组蛋白的制备流程，有利于重组蛋白抗原的大规模生产。在此基础上，本专利技术提供的猪塞内卡病毒重组蛋白疫苗，具有良好的免疫原性和安全性，能够有效激活机体的免疫反应，刺激免疫兔体内产生特异性IgG抗体及保护性中和抗体，具有较高应用价值和经济价值。本专利技术提供的猪塞内卡病毒重组蛋白疫苗还具有制备方法简单高效、生产周期短、生产成本低等优势。
附图说明
[0014]图1：实施例1中重组质粒pHT43
‑
His
‑
VP2的PCR鉴定结果图，其中M为DNAmaker，泳道1为pHT43
‑
His
‑
VP2质粒，泳道2为空白质粒。
[0015]图2：实施例1中枯草芽孢杆菌表达的VP2蛋白原液的SDS
‑
PAGE鉴定结果图，其中M为蛋白maker，泳道1为纯化后VP2蛋白，泳道2为纯化前VP2蛋白。
[0016]图3：本专利技术实施例2中重组质粒pHT43
‑
His
‑
rVP2的PCR鉴定结果图，其中M为DNAmaker，泳道1为pHT43
‑
His
‑
rVP2质粒，泳道2为空白质粒。
[0017]图4为本专利技术中枯草芽孢杆菌表达的重组蛋白进行2倍稀释后的SDS
‑
PAGE鉴定结果，其中M为蛋白maker，泳道1为纯化前重组蛋白，泳道2为纯化后重组蛋白。
[0018]图5为本专利技术实施例3中猪塞内卡病毒重组蛋白疫苗和VP2亚单位免疫新西兰大白兔的特异性抗体检测结果。
[0019]图6为本专利技术实施例3中猪塞内卡病毒重组蛋白疫苗和VP2亚单位疫苗免疫新西兰大白兔的中和抗体检测结果。
具体实施方式
[0020]本专利技术属于生物疫苗制品
，具体涉及一种表达猪塞内卡病毒重组蛋白的枯草芽孢杆菌制备方法及其应用。本专利技术提供一种重组枯草芽孢杆菌，其包含猪塞内卡病毒重组蛋白的编码基因。本专利技术使用Linker连接两个VP2蛋白截短体，通过同源重组技术构建高效表达载体，实现了重组蛋白的高水平表达。本专利技术还提供一种猪塞内卡病毒重组蛋白疫苗，其包含采用重组枯草芽孢杆菌表达的重组蛋白，本专利技术提供的猪塞内卡病毒重组蛋白疫苗具有良好的免疫原性。
[0021]下面结合实施例和附图对本专利技术进行详细的描述。
[0022]实施例1：猪塞内卡病毒(SVA)VP2蛋白原始编码基因重组枯草芽孢杆菌的构建
[0023]根据Gene bank中的SVA VP2基因序列设计一对引物并在上下游引物5
’
端各加上BamH I、Sma I酶切位点，以SVA RNA为模板扩增VP2基因，利用BamH I和Sma I酶切回收的
PCR产物和pUC57克隆载体，再用T4 DNA连接酶进行连接，构建重组克隆质粒pUC57
‑
VP2。利用BamH I和Sma I酶切回收pUC57
‑
VP2和pHT43
‑
His载体，再用T4 DNA连接酶进行连接，构建重组质粒pHT43
‑
His
‑
VP2。将重组质粒转化D本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述的重组枯草芽孢杆菌工程菌中包含有重组表达猪塞内卡病毒VP2蛋白的表达载体。2.如权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述的猪塞内卡病毒VP2蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1。3.如权利要求2所述的重组枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述的猪塞内卡病毒VP2蛋白，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。4.如权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述的猪塞内卡病毒VP2蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO：3。5.如权利要求4所述的重组枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述的猪塞内卡病毒VP2蛋白，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：4。6.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨珍，刘刚，李明义，郭亚飞，李易，刘信冉，张新玲，
申请(专利权)人：青岛海华众康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：