试剂盒及其制备工艺制造技术

本发明专利技术涉及体外诊断技术领域，特别涉及试剂盒及其制备工艺，本发明专利技术为柯萨奇病毒A16型和EV71型重组病毒抗原，用于特异性检测柯萨奇病毒A16型IgM的磁微粒化学发光试剂盒，包括包被鼠抗人

【技术实现步骤摘要】
试剂盒及其制备工艺


[0001]本专利技术涉及体外诊断
，特别涉及试剂盒及其制备工艺。

技术介绍

[0002]柯萨奇病毒A16型(coxsackievirus A16，CA16)属于小核糖核酸病毒目、小核糖核酸病毒科、肠道病毒种。病毒基因组为长度8.5kb的正链RNA，基因组RNA的5
’
端共价偶联vpg蛋白驱动病毒基因组的转录。病毒形态为裸露20面体病毒(T＝3)，病毒颗粒直径为30nm左右。
[0003]手足口病是由肠道病毒引起的传染病，引发手足口病的肠道病毒有20多种(型)，其中以柯萨奇病毒A16型(Cox A16)和肠道病毒71型(EV 71)最为常见。
[0004]手足口病多发生于5岁以下儿童，表现口痛、厌食、低热、手、足、口腔等部位出现小疱疹或小溃疡，多数患儿一周左右自愈，少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。个别重症患儿病情发展快，导致死亡。目前缺乏有效治疗药物，主要对症治疗。
[0005]柯萨奇病毒A16型是引起HFMD主要病原体之一。近几年，非肠道病毒71型(enteroviruses 71，EV71)及肠道病毒感染引起重症感染有逐渐上升趋势，其中主要包括CA16。因此，开发试剂盒区分EV71型和CA16型病毒感染引起的手足口病在诊疗上具有显著的意义。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术提供了试剂盒及其制备工艺，其灵敏度、特异性和精密度优异，且可区分手足口病中的EV71和柯萨奇A16两种病原体，测试间重复性高，标准易于控制。
[0007]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0008]本专利技术提供了组合物，包括肠道病毒71型重组抗原和酶标记的柯萨奇病毒A16型重组抗原；
[0009]所述肠道病毒71型重组抗原包括肠道病毒71型多聚蛋白P1和/或肠道病毒71型3CD蛋白酶；和/或
[0010]所述柯萨奇病毒A16型重组抗原包括柯萨奇病毒A16型多聚蛋白P1和/或柯萨奇病毒A16型3CD蛋白酶；
[0011]其中：编码所述肠道病毒71型多聚蛋白P1的核酸分子具有：
[0012](1)、如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列；或
[0013](2)、如(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(1)的相同或相似；或
[0014](3)、与如(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；
[0015]和/或
[0016]编码所述肠道病毒71型3CD蛋白酶的核酸分子具有：
[0017](4)、如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；或
[0018](5)、如(4)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(4)的相同或相似；或
[0019](6)、与如(4)或(5)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；
[0020]和/或
[0021]编码所述柯萨奇病毒A16型多聚蛋白P1的核酸分子具有：
[0022](7)、如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；或
[0023](8)、如(7)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(7)的相同或相似；或
[0024](9)、与如(7)或(8)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；
[0025]和/或
[0026]编码所述柯萨奇病毒A16型3CD蛋白酶的核酸分子具有：
[0027](10)、如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；或
[0028](11)、如(10)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(10)的相同或相似；或
[0029](12)、与如(10)或(11)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；
[0030]所述多个为2个至500个。
[0031]在本专利技术的一些具体实施方案中，上述组合物中：
[0032]所述柯萨奇病毒A16型包括柯萨奇病毒A16型R37/YN/CHN/2013株、柯萨奇病毒A16型Tainan株、柯萨奇病毒A16型G10株、柯萨奇病毒A16型BJ09/06株或柯萨奇病毒A16型107/Toyama/1990株中的一种或多种；和/或
[0033]所述肠道病毒EV71包括肠道病毒71型BRCR株、肠道病毒71型Fuyang.Anhui.P.R.C/17.08/3株、肠道病毒71型7423/MS/87株、肠道病毒71型STH/MCN/2006株或肠道病毒71型BJ08
‑
Z025
‑
5株中的一种或多种。
[0034]在本专利技术的一些具体实施方案中，上述组合物包括：
[0035]所述酶标记的柯萨奇病毒A16型重组抗原的制备方法包括：将柯萨奇病毒A16型重组抗原与过碘酸钠活化的辣根过氧化物酶以摩尔比1:5混合，孵育，再与含有甘油终浓度为50％的PBS缓冲液混合，获得所述辣根过氧化物酶标记的柯萨奇病毒A16型重组抗原；
[0036]和/或
[0037]所述柯萨奇病毒A16型重组抗原或所述肠道病毒71型重组抗原的制备方法包括：将编码所述柯萨奇病毒A16型重组抗原的基因或编码所述肠道病毒71型重组抗原的基因插入昆虫杆状病毒表达载体，获得重组载体，表达所述重组载体，获得所述柯萨奇病毒A16型重组抗原或所述肠道病毒71型重组抗原。
[0038]在本专利技术的一些具体实施例方案中，上述试剂盒中所述柯萨奇病毒A16型重组抗原或肠道病毒71型重组抗原的所述表达载体的制备方法包括：将柯萨奇病毒A16型或肠道病毒71型的多聚蛋白P1构建到pFBDCMV的PH启动子后方，由PH启动子控制表达；将对应的3CD蛋白酶基因构建到CMV启动子后方，由CMV启动子控制表达，获得所述表达载体。
[0039]在本专利技术的一些具体实施例方案中，上述试剂盒中所述柯萨奇病毒A16型重组抗原或所述肠道病毒71型重组抗原的制备方法包括：采用SF9细胞制备P3代昆虫杆状病毒液，感染SF9细胞，感染复数MOI为1；病毒感染64小时后，收集细胞培养上清，采用下述切向流过
滤、PEG6000沉淀、阴离子交换层析、复合模式层析、密度梯度离心方法中的若干种方法联用纯化，获得所述柯萨奇病毒A16型重组抗原或所述肠道病毒71型重组抗原。
[0040]在本专利技术的一些具体实施方案中，上述组合物的所述昆虫杆状病毒表达载体具有：
[0041](13)、如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或
[0042](14)、如(13)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(13)的相同或相似；或
[0043](15)、与如(13)或(14)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；
[0044]所述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.组合物，其特征在于，包括肠道病毒71型重组抗原和酶标记的柯萨奇病毒A16型重组抗原；所述肠道病毒71型重组抗原包括肠道病毒71型多聚蛋白P1和/或肠道病毒71型3CD蛋白酶；和/或所述柯萨奇病毒A16型重组抗原包括柯萨奇病毒A16型多聚蛋白P1和/或柯萨奇病毒A16型3CD蛋白酶；其中：编码所述肠道病毒71型多聚蛋白P1的核酸分子具有：(1)、如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列；或(2)、如(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(1)的相同或相似；或(3)、与如(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；和/或编码所述肠道病毒71型3CD蛋白酶的核酸分子具有：(4)、如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；或(5)、如(4)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(4)的相同或相似；或(6)、与如(4)或(5)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；和/或编码所述柯萨奇病毒A16型多聚蛋白P1的核酸分子具有：(7)、如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；或(8)、如(7)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(7)的相同或相似；或(9)、与如(7)或(8)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；和/或编码所述柯萨奇病毒A16型3CD蛋白酶的核酸分子具有：(10)、如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；或(11)、如(10)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(10)的相同或相似；或(12)、与如(10)或(11)所示的核苷酸序列至少有70％同源性的核苷酸序列；所述多个为2个至500个。2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，包括：所述酶标记的柯萨奇病毒A16型重组抗原的制备方法包括：将柯萨奇病毒A16型重组抗原与过碘酸钠活化的辣根过氧化物酶以摩尔比1:5混合，孵育，再与含有甘油终浓度为50％的PBS缓冲液混合，获得所述辣根过氧化物酶标记的柯萨奇病毒A16型重组抗原；和/或所述柯萨奇病毒A16型重组抗原或所述肠道病毒71型重组抗原的制备方法包括：将编码所述柯萨奇病毒A16型重组抗原的基因或编码所述肠道病毒71型重组抗原的基因插入昆虫杆状病毒表达载体，获得重组载体，...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏测洋，赵巧辉，李桂林，张晓雷，付光宇，杨增利，吴学炜，
申请(专利权)人：郑州伊美诺生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：