用于检测水痘-带状疱疹病毒感染的试剂及其制备方法技术

本发明专利技术涉及免疫技术检测领域，具体涉及用于检测水痘

【技术实现步骤摘要】
用于检测水痘
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带状疱疹病毒感染的试剂及其制备方法


[0001]本专利技术涉及免疫技术检测领域，具体涉及一种用于检测水痘
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带状疱疹病毒感染的试剂及其制备方法。

技术介绍

[0002]水痘
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带状疱疹病毒(varicella
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zoster virus，VZV)、单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)及非洲淋巴细胞瘤病毒(Epstein
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Barr病毒，EBV)均属疱疹病毒属，都是对人类有致病性的疱疹病毒。VZV是一种双链DNA病毒，为α疱疹病毒亚科，以人类为其唯一自然宿主且具有嗜神经性。VZV的主要传播方式是液滴传播(污染的气溶胶)或污染物传播(如含病毒的小囊泡或焦痂)，是临床水痘和带状疱疹共同的病原体。VZV基因组有71个基因，编码67个不同蛋白，包括6种糖蛋白(gpI～gpVI)，现统一分别命名为gE、gB、gH、gI、gC和gL。在受感染的细胞中，糖蛋白gE、gB和gH极为丰富，在病毒体的胞膜中也存在这些糖蛋白。其中gE蛋白由623个氨基酸组成，其由ORF68基因编码，该基因由1872个碱基组成，位于VZV基因组的短片段区。其N端为544个氨基酸的亲水胞外区(含有信号肽)，C端是17个氨基酸的跨膜疏水区和62个氨基酸的胞内区。gE属于I型膜蛋白，是生成感染性VZV颗粒的必需糖蛋白，也是病毒包膜和感染细胞膜上免疫原性最强、含量最丰富的糖蛋白。
[0003]VZV感染人有两种类型，即原发感染水痘(varicella)和复发感染带状疱疹(zoster)。当患者初次感染VZV时会发生水痘症状，病愈后病毒会终身潜伏于感觉神经节的神经细胞中，数年后，宿主高龄或机体免疫力下降时，潜伏的病毒可能再次激活并大量增殖，对皮肤细胞和局部神经产生损伤，形成带状疱疹。水痘如不及时诊断治疗，将继发水痘性肺炎、脑炎、心肌炎等，甚至造成死亡，而带状疱疹会带给患者长时间的剧烈疼痛，给患者生活带来许多不便，给公共卫生支出带来负担。近年来水痘、带状疱疹发病率出现上升趋势，全球陆续有重症水痘致死的病例报道，而且在人员聚集区域容易造成爆发性流行。
[0004]VZV是感染的常见病毒之一，血液检测有助于病毒的早期诊断。目前临床上主要依靠典型的临床症状和皮损来进行VZV感染诊断，但其他病毒(如柯萨奇病毒、单纯疱疹病毒)感染同样也会引起水痘样皮疹。因此，VZV感染后仅通过典型的临床症状和皮损判断容易漏诊和误诊，需依靠实验室检查进行辅助诊断，确诊依赖于疱疹液接种分离病毒，或血清特异性IgM型抗体阳性。疱疹液接种分离病毒方法操作过于复杂费时，故临床上最常用的方法为血清特异性IgM型抗体检测方法。
[0005]磁颗粒化学发光免疫分析是将磁性分离技术、化学发光技术、免疫分析技术三者结合起来的一种新兴分析方法。该技术充分利用了磁性分离技术的快速且易自动化性，化学发光技术的高灵敏性，以及免疫分析的特异性，在生物分析领域展现了极高的性能。磁颗粒化学发光法是免疫类试剂中的最尖端技术，但其技术壁垒高，其最核心技术为磁珠与抗原的偶联。
[0006]链霉亲和素是由链霉菌分泌的一种蛋白质，它能与生物素发生特异性结合，它们之间的结合力是目前已知的最强的非共价键结合力。因为这一特性，链霉亲和素
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生物素反
应体系在纯化和检测领域得到了广泛的应用。链霉亲和素以同源四聚体的形式存在，每摩尔的四聚体分子可结合四摩尔的生物素分子，所以在免疫检测领域具有信号放大作用，可进一步提高免疫反应的灵敏度，但链霉亲和素与磁珠偶联常存在物理吸附导致连接效率低等情况，从而影响磁珠使用的最终灵敏度。
[0007]此外，研究发现，免疫检测技术中存在的干扰会影响试剂检测的特异性、准确性、灵敏度。引起免疫检测干扰的原因主要包括试剂组分(例如固相载体、化学发光物质等)引起的干扰，待测样本成分引起的干扰和检测方法导致的干扰等。在磁微粒化学发光免疫分析方法中，试剂组分引起的干扰主要是链霉亲和素包被的固相载体与待检测样品中的某些蛋白或疏水分析物之间产生非特异性相结合。链霉亲和素标记磁珠后，为了防止磁珠空余表位产生的非特异性吸附，通常采用惰性蛋白对链霉亲和素磁珠进行封闭，由于磁珠表面链霉素空间位阻的影响，惰性蛋白无法很好的对链霉亲和素磁珠进行封闭，所以在使用过程中，链霉亲和素磁珠会对生物素蛋白抗原、吖啶酯抗体等发生非特异性结合，导致非特异性本底升高，从而影响检测结果及产品性能。
[0008]因此，为了提高VZV感染诊断的准确度和灵敏度，需要开发新的检测试剂。

技术实现思路

[0009]为弥补上述领域存在的不足，本专利技术提供用于检测水痘
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带状疱疹病毒感染的试剂，其具有高灵敏度和高特异性。
[0010]本专利技术提供的用于检测水痘
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带状疱疹病毒感染的试剂，包括R1试剂和R2试剂；
[0011]所述R1试剂为链霉亲和素磁珠工作液，其制备方法包括：将活化的羧基磁珠与链霉亲和素进行第一次偶联；对第一次偶联得到的磁珠进行透析，除去与磁珠物理式结合的链霉亲和素；将透析后的磁珠与链霉亲和素进行第二次偶联；对第二次偶联得到的磁珠进行淬灭，然后将其置于工作液中，即得；所述工作液含有胎牛血清、牛血清白蛋白和赖氨酸；
[0012]所述R2试剂为生物素化VZV gE重组蛋白，所述VZV gE重组蛋白是由人胚肾细胞表达的水痘
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带状疱疹病毒gE糖蛋白胞外域片段。
[0013]在本专利技术的一些实施例中，所述羧基磁珠为纳米磁珠，其粒径为1μm。
[0014]在本专利技术的一些实施例中，使用pH 7.2
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7.6的0.01
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0.03M磷酸盐缓冲液作为透析液对第一次偶联得到的磁珠进行透析。
[0015]在本专利技术的一些实施例中，将第一次偶联得到的链霉亲和素磁珠放入微量透析装置中进行透析，透析液为pH7.4的0.01M磷酸盐缓冲液。每4h换透析液一次，磁力搅拌24h。透析完成后，将微量透析装置放于离心管中离心，得到透析后的链霉亲和素磁珠。
[0016]在本专利技术的一些实施例中，将透析后的链霉亲和素磁珠与链霉亲和素偶联缓冲液混合，4℃温和搅拌12h后，用1ml pH7.4的0.01M磷酸盐缓冲液进行三次磁珠分选清洗，得到第二次偶联后的链霉亲和素磁珠。
[0017]在本专利技术的一些实施例中，使用淬灭缓冲液对第二次偶联得到的链霉亲和素磁珠进行淬灭，所述淬灭缓冲液由2
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羟基乙胺和pH 7.2
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7.6的0.01
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0.03M磷酸盐缓冲液组成。
[0018]在本专利技术的一些实施例中，向第二次偶联得到的链霉亲和素磁珠加入淬灭缓冲液，轻柔混合，在旋转器上孵育45min。用磁力架收集磁珠，去除上清。将磁珠保存在pH7.4的20mM磷酸盐缓冲液中，得到链霉亲和素磁珠悬浮液。
[0019]在本专利技术的一些实施例中，所述人胚肾细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测水痘
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带状疱疹病毒感染的试剂，其特征在于，包括R1试剂和R2试剂；所述R1试剂为链霉亲和素磁珠工作液，其制备方法包括：将活化的羧基磁珠与链霉亲和素进行第一次偶联；对第一次偶联得到的磁珠进行透析，除去与磁珠物理式结合的链霉亲和素；将透析后的磁珠与链霉亲和素进行第二次偶联；对第二次偶联得到的磁珠进行淬灭，然后将其置于工作液中，即得；所述工作液含有胎牛血清、牛血清白蛋白和赖氨酸；所述R2试剂为生物素化VZV gE重组蛋白，所述VZV gE重组蛋白是由人胚肾细胞表达的水痘
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带状疱疹病毒gE糖蛋白胞外域片段。2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，使用pH 7.2
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7.6的0.01
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0.03M磷酸盐缓冲液作为透析液对第一次偶联得到的磁珠进行透析；和/或使用淬灭缓冲液对第二次偶联得到的磁珠进行淬灭，所述淬灭缓冲液由2
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羟基乙胺和pH 7.2
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7.6的0.01
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0.03M磷酸盐缓冲液组成。3.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述人胚肾细胞为HEK293F细胞；和/或所述水痘
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带状疱疹病毒gE糖蛋白胞外域片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。4.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述工作液为含有0.2％
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0.4％(v/v)胎牛血清、4
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6g/ml牛血清白蛋白和0.1
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0.3g/ml赖氨酸的pH 7.2
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7.6的18
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22mM磷酸盐缓冲液。5.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，还包括R3试剂；所述R3试剂为吖啶酯标记的抗人IgM抗体。6.制...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴凡，侯仰龙，李润涛，孙益祺，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：