检测非洲猪瘟病毒的ELISA试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了检测非洲猪瘟病毒的ELISA试剂盒，属于猪瘟病毒病毒检测技术领域，包括材料准备、CD2v蛋白生物信息学分析、CD2v重组蛋白原核表达及纯化、基于CD2v重组蛋白间接ELISA方法的建立和结果分析，采用原核表达系统表达纯化了CD2v内膜重组蛋白，以此蛋白作为包被抗原建立并优化了间接ELISA方法，该方法具有很好的特异性、敏感性和重复性，对ASFV(CD2v)缺失株、PRRSV、FMDV

【技术实现步骤摘要】
检测非洲猪瘟病毒的ELISA试剂盒


[0001]本专利技术属于猪瘟病毒病毒检测
，具体涉及检测非洲猪瘟病毒的ELISA试剂盒。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的高度传染性疫病，所有年龄段的野猪和家猪对其均易感，其高死亡率和快速传播给全世界养猪生产造成巨大经济损失，ASFV是一种较大的具有二十面体结构的双链DNA虫媒性囊膜病毒，是目前已知的唯一虫媒传播DNA病毒，ASFVEP402R基因编码的CD2v蛋白是一种跨膜蛋白，具有N端信号肽和1个跨膜结构域，与宿主CD2蛋白有相似之处，ASFVCD2v蛋白与宿主CD2蛋白共有2个IgSF结构域，包括1个缺乏常见二硫键的N末端V型结构域和1个膜近端C型结构域，CD2v蛋白是细胞外病毒粒子与红细胞结合所必需的物质，具有介导ASFV感染细胞周围出现红细胞吸附(HAD)的功能，从分离毒株的基因组中删除EP402R基因，不会影响该病死亡率，但会延迟病毒血症的发生以及延长病毒传播到组织，世界动物卫生组织(WOAH)推荐的荧光定量PCR(qPCR)和ELISA方法检测时，在口腔、直肠和血液样本中很难区分出CD2v缺失株。

技术实现思路

[0003]为了克服现有技术中的上述不足，本专利技术的目的之一在于提供检测非洲猪瘟病毒的ELISA试剂盒，可以实现ASFV野毒感染与CD2v缺失株感染的鉴别诊断适用于建立快速检测法。
[0004]本专利技术的目的之二在于收集并分析国内流行株的基因进化特性，为后续致病机理研究及疫苗研发等提供科学数据，便于进行良好的防治措施。
[0005]为了实现上述目的之一，本专利技术采用以下技术方案：
[0006]本专利技术提供检测非洲猪瘟病毒的ELISA试剂盒，所述ELISA试剂盒检测具体步骤如下：
[0007]S1、材料准备，包括血清、表达质粒、菌株和试剂，试剂包括LB培养基、LB琼脂培养基、卡那霉素、异丙基
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β
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D
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硫代半乳糖苷(IPTG)、20
×
ELISA洗涤液、ELISA底物液、ELISA终止液；
[0008]S2、CD2v蛋白生物信息学分析，合成目的片段，将S1中的RNA使用AMV反转录试剂盒进行cDNA的合成，进行PCR扩增，将PCR产物回收纯化后再将回收产物连接转化，最后在进行质粒抽提；
[0009]S3、CD2v重组蛋白原核表达及纯化，包括CD2v重组表达质粒构建和CD2v重组蛋白诱导表达与鉴定；
[0010]S4、基于CD2v重组蛋白间接ELISA方法的建立，包括最佳反应条件优化、临界值确定、特异性试验、敏感性试验、重复性试验和符合性试验；
[0011]S5、结果分析。
[0012]优选的，所述CD2v重组蛋白原核表达及纯化步骤中，CD2v重组蛋白诱导表达与鉴定将pET28a
‑
CD2v
‑
IS重组质粒转化到BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞，经PBS洗涤后重悬，冰浴下超声破碎后，分别收集上清与沉淀制样，并设置未诱导组与pET
‑
28a(+)空载体的阴性对照。
[0013]优选的，所述基于CD2v重组蛋白间接ELISA方法的建立步骤中，最佳反应条件优化包括优化纯化蛋白溶液质量浓度和反应时间。
[0014]优选的，所述基于CD2v重组蛋白间接ELISA方法的建立步骤中，临界值确定通过每份血清做两个重复，计算所有阴性血清OD450nm的平均值与变异系数(CV)，以其平均值+3
×
CV的值除以平均值作为临界值。
[0015]优选的，所述基于CD2v重组蛋白间接ELISA方法的建立步骤中，特异性试验通过选取ASFV(CD2v编码基因缺失)抗体阳性血清2份、PRV
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gE抗体阳性血清4份与CSFV、PRRSV、FMDV
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O、PCV2抗体阳性血清各5份，并设置ASFV阳性血清与阴性血清对照。
[0016]优选的，所述基于CD2v重组蛋白间接ELISA方法的建立步骤中，敏感性试验通过ASFV标准阳性血清按1:10～1:5120进行倍比稀释，检测不同稀释倍数的标准阳性血清。
[0017]优选的，所述基于CD2v重组蛋白间接ELISA方法的建立步骤中，重复性试验通过同一批次包被的酶标板检测4份血清，每份血清2个重复，使用不同批次包被的酶标板检测4份血清，每份血清2个重复。
[0018]与现有技术相比，本专利技术具有的有益效果如下：
[0019]通过原核表达系统表达纯化了CD2v内膜重组蛋白，并以此蛋白作为包被抗原建立并优化了间接ELISA方法，该方法具有很好的特异性、敏感性和重复性，对ASFV(CD2v)缺失株、PRRSV、FMDV
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O型、PRV
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gE、CSFV、PCV2等常见的猪病抗体阳性血清均无交叉反应，可检测到稀释1280倍的ASFV标准阳性血清样本，如果同时结合其他ASFV结构蛋白制成的ELISA检测试剂盒，可应用于ASFV野毒感染与CD2v缺失株感染的鉴别诊断。
附图说明
[0020]为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0021]图1是用本申请ELISA试剂盒检测方法流程图。
具体实施方式
[0022]为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下将结合实施例对本申请的技术方案进行清楚、完整的描述。应当理解此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
[0023]所用的试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0024]实施例1
[0025]本实施例提供检测非洲猪瘟病毒的ELISA试剂盒，如图1所示，ELISA试剂盒检测具体步骤如下：
[0026]S1、材料准备，包括血清、表达质粒、菌株和试剂，试剂包括LB培养基、LB琼脂培养基、卡那霉素、异丙基
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β
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D
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硫代半乳糖苷(IPTG)、20
×
ELISA洗涤液、ELISA底物液、ELISA终止液；
[0027]S2、CD2v蛋白生物信息学分析，合成目的片段，将S1中的RNA使用AMV反转录试剂盒进行cDNA的合成，进行PCR扩增，将PCR产物回收纯化后再将回收产物连接转化，最后在进行质粒抽提；
[0028]S3、CD2v重组蛋白原核表达及纯化，包括CD2v重组表达质粒构建和CD2v重组蛋白诱导表达与鉴定；
[0029]S4、基于CD2v重组蛋白间接ELISA方法的建立，包括最佳反应条件优化、临界值确定、特异性试验本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测非洲猪瘟病毒的ELISA试剂盒，其特征在于，所述ELISA试剂盒检测具体步骤如下：S1、材料准备，包括血清、表达质粒、菌株和试剂，试剂包括LB培养基、LB琼脂培养基、卡那霉素、异丙基
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β
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D
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硫代半乳糖苷(IPTG)、20
×
ELISA洗涤液、ELISA底物液、ELISA终止液；S2、CD2v蛋白生物信息学分析，合成目的片段，将S1中的RNA使用AMV反转录试剂盒进行cDNA的合成，进行PCR扩增，将PCR产物回收纯化后再将回收产物连接转化，最后在进行质粒抽提；S3、CD2v重组蛋白原核表达及纯化，包括CD2v重组表达质粒构建和CD2v重组蛋白诱导表达与鉴定；S4、基于CD2v重组蛋白间接ELISA方法的建立，包括最佳反应条件优化、临界值确定、特异性试验、敏感性试验、重复性试验和符合性试验；S5、结果分析。2.根据权利要求1所述的检测非洲猪瘟病毒的ELISA试剂盒，其特征在于：所述CD2v重组蛋白原核表达及纯化步骤中，CD2v重组蛋白诱导表达与鉴定将pET28a
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CD2v
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IS重组质粒转化到BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞，经PBS洗涤后重悬，冰浴下超声破碎后，分别收集上清与沉淀制样，并设置未诱导组与pET
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28a(+)空载体的阴性对照。3.根据权利要求1所述的检测非洲猪瘟病毒的ELI...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡杰，蒋永青，许芳，郭柏莹，廖景，韦国钊，
申请(专利权)人：深圳市绿诗源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：