一种人工猪圆环病毒、制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种人工猪圆环病毒、制备方法及其应用，将如SEQ ID NO.2所示的Avi序列插入到猪圆环病毒全基因组序列中，具体插入位置为PCV Cap蛋白C端；所述的猪圆环病毒为PCV2、PCV3和PCV4中的一种，通过在PCV Cap蛋白的C端添加一个Avi标签，并且借用生物素

【技术实现步骤摘要】
一种人工猪圆环病毒、制备方法及其应用


[0001]本专利技术属于病毒分子生物学技术及生物工程领域，具体涉及一种人工猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)、制备方法，人工制备的带标记的PCV可用于猪圆环病毒感染及致病机制的研究等。

技术介绍

[0002]猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)是无包膜结构的单股链DNA病毒。截至目前，共发现四种猪圆环病毒亚型，即PCV1、PCV2、PCV3和PCV4。基因组大小均在1700
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2000nt左右，为单股环状DNA分子结构，在环状基因组上主要包含两个方向相反的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)。ORF1编码复制相关的Rep蛋白，ORF2编码Cap蛋白。Cap蛋白是病毒主要抗原蛋白，其上有病毒主要的抗原决定簇，相较于Rep蛋白具有更强的免疫原性，并且在病毒传播和侵染过程中起重要作用。
[0003]通常认为PCV1不致病，而PCV2是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪呼吸系统疾病综合体、皮炎肾病综合征等为特征的猪圆环病毒病的主要病源，且可导致感染猪只的免疫抑制。大量文献报道，PCV3和PCV4有一定致病性，可能也与猪的呼吸系统疾病、腹泻和皮炎与肾病综合征等相关，且其在猪群中的感染率逐渐上升，已成为值得关注的猪圆环病毒亚型。值得重视的是，有关猪圆环病毒的感染及致病机制仍不太清楚。
[0004]为了进一步观察病毒侵染后整个生命周期和了解病毒感染及致病机制，对病毒进行动态示踪分析是一种常见手段。然而，传统的荧光标记方法，如荧光染料和荧光蛋白标记，存在荧光强度低、易猝灭、难以长时间追踪的问题。量子点是具有显著的光稳定性和亮度的荧光纳米材料，被广泛用作荧光标记探针。量子点的卓越发光性质使其非常适合用于标记小尺寸的病毒，从而实现长时间的单颗粒示踪。Avi
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Tag指的是将目的蛋白的N端或者C端加上由15个氨基酸残基组成的标签，该标签可以被生物素连接酶BirA特异性识别，并在目的蛋白Avi
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Tag标签的赖氨酸残基共价结合生物素，从而实现目的蛋白的生物素化。随后，量子点标记的链霉亲和素与生物素化的病毒结合，就可把量子点标记到病毒上，从而进行病毒示踪检测及功能研究。
[0005]目前，未见人工制备的带Avi
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Tag的猪圆环病毒用于疫苗研发、建立病毒感染检测方法、病毒感染及致病机制的研究。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供一种人工猪圆环病毒，通过在PCV Cap蛋白的C端添加一个Avi标签，并且借用生物素
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亲和素系统将量子点标记到Avi标签修饰的PCV(PCV
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Avi)上，得到的标记PCV可用于疫苗研发、病毒感染检测方法的建立、病毒感染及致病机制的研究，进一步对PCV在细胞中的感染进行示踪分析。
[0007]本专利技术提供一个人工DNA片段，其是将如SEQ ID NO.2所示的Avi序列插入到猪圆环病毒全基因组序列中，具体插入位置为PCV Cap蛋白C端；所述的猪圆环病毒为PCV2、PCV3
和PCV4中的一种。
[0008]本专利技术中所述的猪圆环病毒为PCV2时，上述的DNA片段为如SEQ ID NO.5所示，是在如SEQ ID NO.4所示的PCV2全基因组序列(GenBank：JQ955679.1)的第1028
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1029碱基之间插入如SEQ ID NO.2所示的Avi序列ggcctgaacg acatcttcga ggcccagaag atcgagtggc acgag得到。
[0009]本专利技术中所述的猪圆环病毒为PCV3时，上述的DNA片段为如SEQ ID NO.3所示，是在如SEQ ID NO.1所示的PCV3全基因组序列(GenBank：MF318451.1)的第1345和1346位碱基之间插入如SEQ ID NO.2所示的Avi序列得到。
[0010]本专利技术中所述的猪圆环病毒为PCV4时，上述的DNA片段为如SEQ ID NO.7所示，是在如SEQ ID NO.6所示的PCV4全基因组序列(GenBank：MT311854.1)的第1049
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1050碱基之间插入如SEQ ID NO.2所示的Avi序列得到。
[0011]如SEQ ID NO.4所示的PCV2全基因组序列的第1028
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1029碱基之间插入如SEQ ID NO.2所示的Avi序列，从而获得的如SEQ ID NO.5所示的DNA片段；如SEQ ID NO.1所示的PCV3全基因组序列的第1345
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1346位碱基之间插入如SEQ ID NO.2所示的Avi序列，从而获得的如SEQ ID NO.3所示的DNA片段；如SEQ ID NO.6所示的PCV4全基因组序列的第1049
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1050碱基之间插入如SEQ ID NO.2所示的Avi序列，从而获得的如SEQ ID NO.7所示的DNA片段。
[0012]本专利技术还提供一种重组载体，所述的重组载体包括上述的DNA片段，具体是将上述的DNA片段替换pBluescript SK(+)质粒上Kpn I和Sac I位点之间序列。
[0013]本专利技术还提供一种人工制备猪圆环病毒的方法，具体是将上述的重组载体转染进入受体细胞，得到人工猪圆环病毒。所述的受体细胞为PK
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15细胞。
[0014]本专利技术还提供一种上述方法制备得到的人工猪圆环病毒。
[0015]本专利技术还提供一种人工猪圆环病毒细胞模型，具体是将上述的人工猪圆环病毒感染猪细胞得到的重组细胞。
[0016]本专利技术还提供一种人工猪圆环病毒或人工猪圆环病毒细胞模型在进行猪圆环病毒和疫苗研究中的应用，或者在猪圆环病毒药物筛选中的应用，或者猪圆环病毒感染检测方法中的应用。上述的应用包括将人工猪圆环病毒和生物素化试剂混匀后孵育，再加入量子点试剂孵育得到量子点标记的人工猪圆环病毒。
[0017]本专利技术在现有的PCV全基因组的基础上插入Avi序列，实现了人工制备带Avi标签的PCV2
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Avi病毒、PCV3
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Avi病毒和PCV4
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Avi病毒。
[0018]构建的感染性克隆pSK
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PCV2
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Avi是在pBluescript SK(+)质粒的基础上，插入如SEQ ID NO.5所示的人工合成PCV2
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Avi基因序列DNA而成，如SEQ ID NO.2所示的Avi序列位于PCV2 Cap基因序列上游特定位置。
[0019]构建的感染性克隆pSK
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PCV3
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Avi是在pBluescript SK(+)质粒的基础上，插入如SEQ ID NO.3所示的人工合成PCV3
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Avi基因序列DNA而本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一个DNA片段，其特征在于：所述的DNA片段其是将如SEQ ID NO.2所示的Avi序列插入到猪圆环病毒全基因组序列中，具体插入位置为PCV Cap蛋白C端；所述的猪圆环病毒为PCV2、PCV3和PCV4中的一种。2.如权利要求1所述的DNA片段，其特征在于：如SEQ ID NO.4所示的PCV2全基因组序列的第1028
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1029碱基之间插入如SEQ ID NO.2所示的Avi序列，从而获得的如SEQ ID NO.5所示的DNA片段；如SEQ ID NO.1所示的PCV3全基因组序列的第1345
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1346位碱基之间插入如SEQ ID NO.2所示的Avi序列，从而获得的如SEQ ID NO.3所示的DNA片段；如SEQ ID NO.6所示的PCV4全基因组序列的第1049
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1050碱基之间插入如SEQ ID NO.2所示的Avi序列，从而获得的如SEQ ID NO.7所示的DNA片段。3....

【专利技术属性】
技术研发人员：任林柱，牛谷雨，郑佳玮，陈思，李雪，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：