P30-Fn融合蛋白、抗ASFV-P30蛋白的纳米抗体-融合报告蛋白及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种P30

【技术实现步骤摘要】
P30
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Fn融合蛋白、抗ASFV
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P30蛋白的纳米抗体
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融合报告蛋白及应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种P30
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Fn融合蛋白、抗ASFV
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P30蛋白的纳米抗体
‑
融合报告蛋白及应用。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟(African swine fever，ASF)被世界动物卫生组织列为“应报告疾病”，是野生猪和家猪的一种高致死率的病毒性疾病，死亡率接近100％。这种疾病是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的，该病毒有一个大的(170
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193k bp)双链DNA基因组，包含151
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167个基因，大多数编码基因的功能尚不清楚。迄今为止，非洲猪瘟已蔓延到世界上大多数国家，这给养猪业带来了巨大的痛苦和巨大的经济损失。
[0003]在许多研究中，利用ASFV的结构蛋白或非结构蛋白来开发ASFV抗体检测的免疫分析方法，主要包括P72蛋白、P30蛋白、P54蛋白、CD2V蛋白和pp62蛋白，这些蛋白在感染猪中引发相应的高抗体滴度。一种理想的抗原能刺激免疫系统更早地产生强大而持久的抗体，是血清学检测方法的基础。基于抗原的间接ELIsA是一种简单、快速的兽医临床诊断中ASFV抗体监测方法。但在敏感性和特异性上仍存在缺陷，限制了其发展和应用。因此，优化抗原和高性能抗体是开发ASFV抗体ElisA检测方法的关键。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种P30
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Fn融合蛋白、抗ASFV
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P30蛋白的纳米抗体
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融合报告蛋白及应用，本专利技术利用从免疫的双峰驼文库中筛选出抗ASFV
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P30蛋白的特异性纳米抗体，并将其与辣根过氧化物酶(HRP)融合后在HEK293T细胞中表达。同时将P30蛋白展示在铁蛋白的表面，形成融合纳米颗粒。建立基于铁蛋白展示的P30纳米颗粒蛋白和纳米抗体
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辣根过氧化物酶融合物的新型竞争ELISA(cELISA)。实验证实：新开发的cELISA可用于快速检测血清标本中的ASFV抗体，具有较高的敏感性和特异性,可以检测高达1：200稀释倍数的临床阳性血清，并且与其他猪病毒，如PRRSV、PPV、CSFV、TGEV、PEDV、PCV和SIV的阳性血清没有交叉反应。与市售试剂盒相比，检测267份临床样本的符合率为98.1％，卡伯值为0.96。此外，该方法重复性好，批内、批间变异系数均小于10％。综上，本专利技术新开发的cELISA是一种简单、快速、灵敏和低成本的免疫分析方法，在临床样本中检测ASFV抗体具有很大的潜力。
[0005]第一方面，本申请实施例提供了一种编码重组ASFV
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P30蛋白的基因，所述基因的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
[0006]第二方面，本申请实施例提供了一种重组ASFV
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P30蛋白，所述重组ASFV
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P30蛋白是由权利要求1所述的基因编码得到，所述重组ASFV
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P30蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0007]第三方面，本申请实施例提供了一种编码P30
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Fn融合蛋白的基因，所述P30
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Fn融合蛋白的基因包括编码如权利要求1所述的重组ASFV
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P30蛋白的基因。
[0008]第四方面，本申请实施例提供了一种P30
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Fn融合蛋白，所述P30
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Fn融合蛋白的基因是将铁蛋白亚基螺旋ε和环(147
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174aa)的序列替换成权利要求1所述的编码重组ASFV
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P30蛋白的基因。
[0009]第五方面，本申请实施例提供了一种抗ASFV
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P30蛋白的纳米抗体
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融合报告蛋白，所述抗ASFV
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P30蛋白的纳米抗体
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融合报告蛋白是由权利要求2所述的ASFV
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P30重组蛋白与辣根过氧化物酶的融合蛋白。
[0010]第六方面，本申请实施例提供了一种检测非洲猪瘟的试剂盒，所述试剂盒包括：
[0011](a)第四方面所述的P30
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Fn融合蛋白；以及
[0012](b)第五方面所述的抗ASFV
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P30蛋白的纳米抗体
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融合报告蛋白。。
[0013]第七方面，本申请实施例提供了一种竞争酶联免疫吸附方法，所述方法采用第四方面所述的P30
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Fn融合蛋白和第五方面所述的抗ASFV
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P30蛋白的纳米抗体
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融合报告蛋白。
[0014]第八方面，本申请实施例提供了一种检测血清样本中ASFV抗体的竞争ELISA检测方法，所述方法采用第四方面所述的P30
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Fn融合蛋白和第五方面所述的抗ASFV
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P30蛋白的纳米抗体
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融合报告蛋白。
[0015]相较于现有技术，本申请实施例提供的上述方案至少具有以下有益效果：
[0016]本专利技术利用从免疫的双峰驼文库中筛选出抗ASFV
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P30蛋白的特异性纳米抗体，并将其与辣根过氧化物酶(HRP)融合后在HEK293T细胞中表达。同时将P30蛋白展示在铁蛋白的表面，形成融合纳米颗粒。建立基于铁蛋白展示的P30纳米颗粒蛋白和纳米抗体
‑
辣根过氧化物酶融合物的新型竞争ELISA(cELISA)。实验证实：新开发的cELISA可用于快速检测血清标本中的ASFV抗体，具有较高的敏感性和特异性,可以检测高达1：200稀释倍数的临床阳性血清，并且与其他猪病毒，如PRRSV、PPV、CSFV、TGEV、PEDV、PCV和SIV的阳性血清没有交叉反应。与市售试剂盒相比，检测267份临床样本的符合率为98.1％，卡伯值为0.96。此外，该方法重复性好，批内、批间变异系数均小于10％。总之，本专利技术新开发的cELISA是一种简单、快速、灵敏和低成本的免疫分析方法，在临床样本中检测ASFV抗体具有很大的潜力。
附图说明
[0017]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0018]图1非洲猪瘟病毒P30蛋白的表达、纯化及免疫原性鉴定图；
[0019]图2抗非洲猪瘟病毒P30蛋白纳米体库的构建与筛选图；
[0020]图3抗ASFV
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P30蛋白12个纳米体
本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种编码重组ASFV
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P30蛋白的基因，其特征在于，所述基因的基因序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种重组ASFV
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P30蛋白，其特征在于，所述重组ASFV
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P30蛋白是由权利要求1所述的基因编码得到，所述重组ASFV
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P30蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.一种编码P30
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Fn融合蛋白的基因，其特征在于，所述P30
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Fn融合蛋白的基因包括编码如权利要求1所述的重组ASFV
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P30蛋白的基因。4.一种P30
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Fn融合蛋白，其特征在于，所述P30
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Fn融合蛋白的基因是将铁蛋白亚基螺旋ε和环(147
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174aa)的序列替换成权利要求1所述的编码重组ASFV
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P30蛋白的基因。5.一种抗ASFV
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P30蛋白的纳米抗体
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融合报告蛋白，其特征在于，所述抗ASFV
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P30蛋白的纳米抗体
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【专利技术属性】
技术研发人员：王红宁，谷奎，杨铭，张媛媛，杨鑫，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：