一种用于检测非洲猪瘟抗体的E183L基因胶体金试纸条的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种用于检测非洲猪瘟抗体的E183L基因胶体金试纸条的制备方法，属于分子诊断技术领域。为了克服现有技术的不足，本发明专利技术提供一种检测非洲猪瘟抗体胶体金试纸条的制备方法，该方法通过分别合成ASFV的E183L基因和猪IgG的Fc基因，在其基因间创造性加入柔性蛋白基因后构建表达载体，将表达载体转化感受态细胞后进行诱导表达，表达的ASFV重组蛋白提取纯化后作为检测带，金黄色葡萄球菌蛋白A作为质控带即可得到，该试纸条的灵敏度可以达到1:320，特异性良好，与伪狂犬病毒、经典猪瘟病毒、乙脑病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒以及猪圆环病毒1型和2型均没有交叉反应，稳定性良好。好。好。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测非洲猪瘟抗体的E183L基因胶体金试纸条的制备方法


[0001]本专利技术涉及一种用于检测非洲猪瘟抗体的E183L基因胶体金试纸条的制备方法，属于分子诊断


技术介绍

[0002]非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的一种猪的高度传染性疾病。ASF是目前对我国养猪产业造成损失最大的疫病，该病毒基因组庞大、结构复杂且还有许多免疫逃避机制，目前还没有研发出有效针对该病的疫苗和药物，因此对该病的快速准确的诊断对该病的防控中显得格外重要。随着ASFV低毒力天然突变株在我国的出现，ASF呈现持续、非致死、亚急性或慢性发病的特点，ASFV感染会在猪体内引起强烈的体液免疫反应并持续很长时间。感染ASFV后的康复猪血液内很难检测到病毒，但血液内却含有较高的抗体水平，这也使得ASF血清抗体检测方法的研究对ASF的防控以及净化显得尤为重要。
[0003]非洲猪瘟在我国爆发后对我国的养猪业造成了严重的经济损失，目前对该疾病的及时准确的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测非洲猪瘟抗体胶体金试纸条的制备方法，其包括如下步骤：(1)目的基因融合扩增：参照GenBank中ASFV(Pig/HLJ/2018株)基因的编码序列，分别合成ASFV的E183L基因和猪IgG的Fc基因，设计目的基因的上游引物和下游引物对目的基因进行扩增；E183L基因的基因序列SEQ.No.5所示，猪IgG的Fc基因的基因序列如SEQ.No.6所示；将Fc段基因与E183L基因融合之间增加15个氨基酸长的柔性蛋白基因进行融合PCR，其中柔性蛋白基因的基因序列如SEQ.No.7所示；向反应体系中加E183L基因的上游引物和Fc片段基因的下游引物各2μL，继续按照融合PCR的扩增程序扩增25个循环，反应结束后用1％的琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳鉴定，目的基因进行回收，测定浓度后置于
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20℃冰箱保存；(2)重组表达载体的构建与鉴定：将pColdI载体和回收的目的基因用XbaI和EcoR I内切酶在37℃水浴锅4h进行双酶切反应，酶切完成后用1％的琼脂糖凝胶对酶切产物进行电泳鉴定，目的片段回收后测定浓度置于
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20℃冰箱保存；使用T4连接酶对目的片段和pCold I载体进行16℃过夜连接反应，将连接产物加入到DH5α感受态细胞中转化，转化完成后菌液涂到氨苄抗性的平板上37℃培养过夜，挑取单菌落至含有氨苄抗性的LB培养基中放置37℃培养箱培养6h，选取阳性单克隆；(3)ASFV重组蛋白的原核表达、纯化及鉴定：将构建完成的阳性重组质粒转化至感受态细胞中BL21(DE3)，挑选单克隆菌培养过夜，取1mL菌液加入至200mL LB培养基中，摇床培养至OD在0.6
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0.8时，加入IPTG使其在1mM的IPTG浓度下诱导表达；将菌液进行冰浴超声破碎后进行冷冻离心提取包涵体蛋白，使用8M尿素的裂解液重悬沉淀，使用Ni
2+
亲和层析方法对重组蛋白进行纯化，使用抗His标签单抗作为一抗，用带有HRP的羊抗鼠二抗对诱导表达后得到的ASFV重组蛋白进行Western
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blot鉴定；(4)检测非洲猪瘟抗体胶体金试纸条的制备：将金标垫提前用重悬液进行浸润后，放置烘箱中烘干，然后将PVC底板、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组装在一起，将纯化的p54
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Fc蛋白和SPA稀释至0.5mg/mL，分别标记到硝酸纤维素膜的检测线上和质控线上，即得检测非洲猪瘟抗体胶体金试纸条。2.根据权利要求1所述的一种检测非洲猪瘟抗体胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，所述的E183L基因上游引物如SEQ.No.1所示，E183L基因下游引物如SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏建超，马志永，李昱昊，张妍，杨扬，管志欣，张俊杰，郑家杨，邱亚峰，李宗杰，李蓓蓓，刘珂，邵东华，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所，
类型：发明
国别省市：