用噬菌体单链制备技术体外重组cccDNA分子模型的方法及应用技术

本发明专利技术公开了用噬菌体单链制备技术体外重组cccDNA分子模型的方法及应用，方法包括R1、构建重组质粒，载体质粒插入部分λ噬菌体基因组，并构建入目标基因组序列；R2、制备单链形式cccDNA，将步骤R1构建的重组质粒转化入大肠杆菌并用VCSM13辅助噬菌体进行感染，包装出基因组上含有目标基因组全长序列的噬菌体，抽提M13噬菌体基因组并引入Zn

【技术实现步骤摘要】
用噬菌体单链制备技术体外重组cccDNA分子模型的方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，具体是用噬菌体单链制备技术体外重组cccDNA分子模型的方法及应用。

技术介绍

[0002]DNA在自然界中存在单链、双链以及线性、环状等多种结构,其中共价闭合环状的DNA形式(covalently closed circular DNA，cccDNA)不仅作为许多DNA病毒基因组在宿主细胞中维持潜伏感染的分子结构,也可作为基因治疗载体、DNA疫苗等生物制品的递送形式,在基础研究和药物研发等方面均有所应用。目前对于cccDNA的体外构建方法，多依赖于含有原核序列骨架的质粒,以及近来推崇的微环DNA技术(minicircle DNA)。微环DNA相比于传统质粒载体，在构建时插入了重组酶识别位点，经重组酶作用可去除识别位点外的质粒骨架,从而形成以目标基因序列为主的微环DNA形式。然而,重组位点作为外源序列仍有引入免疫原性的风险,可能对目标基因的转录调控过程产生影响,因此我们希望能够利用噬菌体单链制备技术,建立可在体外重组得到无外源序列cccDNA分子的新方法。本专利中以乙型肝炎病毒基因组HBV cccDNA的构建作为示例进行阐述。
[0003]乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)转录复制的唯一模版以共价闭合环状DNA形式存在于感染者肝细胞核内难以清除,是乙型肝炎病毒持续性感染的核心,也是慢性乙型肝炎难以治愈的关键所在。HBV感染产生的cccDNA是由病毒颗粒或核心颗粒包裹的松弛环状DNA(rcDNA)在宿主DNA聚合酶和连接酶等宿主蛋白作用下修复形成的,胞核内的HBV cccDNA上即结合有宿主组蛋白等多种蛋白,又与病毒Core蛋白和X蛋白相互作用,从而形成为微小染色体(minichromosome)的结构长期稳定存在与胞核内,并可利用宿主RNA聚合酶转录出HBV mRNA,包含蛋白翻译和逆转录过程复制模版的前基因组RNA(pregenomic RNA,pgRNA)。因此,以攻克慢性乙型肝炎实现彻底治愈为目标,研发靶向cccDNA的治疗药物是无法规避的重要环节。然而目前由于体内外实验模型的限制,研究人员对HBV cccDNA的生物学特性认知相对有限。
[0004]现有的cccDNA研究系统主要包括感染系统、整合HBV基因组的稳定细胞株以及位点特异性重组诱导生成重组cccDNA(recombinant DNA,rcccDNA)三种。感染系统虽然作为HBV研究的金标准,但其受限于人原代肝细胞的高昂价格和获取困难等因素,难以作为广泛使用的研究系统；而HepRG、HepG2
‑
NTCP等经改造的肿瘤细胞系感染效率相对较低。整合有HBV基因组的稳定细胞株包括HepAD38和HepDES19等通过核心颗粒中rcDNA的回补途径于胞核内产生cccDNA,其含量限于pg数量级，仅可用Southern印迹杂交检测到核内信号，因此也限制了应用于病毒基因组与宿主蛋白相互作用等方面的研究可能。近来，复旦大学邓强课题组报道的基于Cre/loxp介导的位点特异性重组可提升细胞内rcccDNA的拷贝数,但无法规避母本质粒的存在及二倍体重组产物等问题；罗氏公司所报道的以微环DNA技术为基础的诱导attP/attB位点重组的HBVcircle系统为HBV cccDNA的研究提供新的选择，除所保留
的重组位点外在序列与结构上与HBV cccDNA基本一致。但在模型应用中发现，其上所保留的外源序列对复制能力影响较大，与真实的cccDNA生物活性仍不完全相同。

技术实现思路

[0005]本专利技术通过噬菌体单链制备系统,经体外重组获得不含有外源序列的cccDNA分子模型的方法，为体外获得cccDNA分子(比如，HBVcccDNA分子)及对其体内外特性研究提供了一个新技术平台。
[0006]为达此目的，本专利技术提供如下的技术方案：
[0007]本专利技术的第一个方面，提供了一种利用噬菌体单链制备技术体外重组cccDNA分子模型的方法，包括一下步骤：
[0008]R1、构建重组质粒，载体质粒插入部分λ噬菌体基因组，并构建入目标基因组序列；
[0009]R2、制备单链形式cccDNA，将步骤R1构建的重组质粒转化入大肠杆菌并用VCSM13辅助噬菌体进行感染，包装出基因组上含有目标基因组全长序列的噬菌体，抽提M13噬菌体基因组并引入Zn
2+
切割后，获得单链形式的cccDNA；
[0010]R3、体外重组cccDNA，将步骤R2获得的cccDNA正负链退火经连接酶连接修复，即为体外重组cccDNA分子模型。
[0011]在本专利技术中，通过噬菌体单链制备系统，经体外重组获得不含有外源序列的cccDNA分子模型的方法，为体外获得cccDNA分子及对其体内外特性研究提供了一个新技术平台。
[0012]本专利技术的第二个方面，提供了一种利用噬菌体单链制备技术体外重组HBV cccDNA分子模型的方法，包括以下步骤：
[0013]S1、构建重组质粒，载体质粒插入部分λ噬菌体基因组，并构建入Ⅰ类脱氧核酶序列、Ⅱ类脱氧核酶序列和正负链全长乙型肝炎病毒HBV基因组序列；
[0014]S2、制备单链形式cccDNA，将步骤S1构建的重组质粒转化入大肠杆菌并用VCSM13辅助噬菌体进行感染，包装出基因组上含有HBV全长序列的噬菌体，抽提M13噬菌体基因组并引入Zn
2+
切割后，获得单链形式的HBV cccDNA；
[0015]S3、体外重组HBV cccDNA，将步骤S2获得的HBV cccDNA正负链退火经连接酶连接修复，即为体外重组HBV cccDNA分子模型。
[0016]在本专利技术中，载体质粒插入部分λ噬菌体基因组，只是一种加长策略,主要由目标单链和载体长度决定.加长目的主要是为了易于回收目标单链。
[0017]优选的，步骤S1中，HBV序列5
’
端插入I类脱氧核酶，I类脱氧核酶所产生的疤痕序列5
’‑
AG
‑3’
两碱基与HBV单链序列前两个碱基重叠。
[0018]优选的，步骤S1中，HBV序列3
’
端插入Ⅱ类脱氧核酶；进一步优选的，可以根据HBV单链序列最后一个碱基选择对应的II类脱氧核酶，比如3
’
端最后一个碱基为G,选择II
‑
R1a；最后一个碱基为A，选择II
‑
R1b；最后一个碱基为T，选择II
‑
R1c；最后一个碱基为C，选择II
‑
R1d。但是，符合最后一个为特定碱基序列的原则下，II类脱氧核酶的序列并非唯一的，进一步有选项中只是举例。
[0019]在本专利技术中，最后一个碱基选择对应的II类脱氧核酶，若不选用此类位点也可实现切割，但效率不高。
[0020]优选的，步骤S1获得的重组质粒的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用噬菌体单链制备技术体外重组cccDNA分子模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：R1、构建重组质粒，载体质粒插入部分λ噬菌体基因组，并构建入目标基因组序列；R2、制备单链形式cccDNA，将步骤R1构建的重组质粒转化入大肠杆菌并用VCSM13辅助噬菌体进行感染，包装出基因组上含有目标基因组全长序列的噬菌体，抽提M13噬菌体基因组并引入Zn
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切割后，获得单链形式的cccDNA；R3、体外重组cccDNA，将步骤R2获得的cccDNA正负链退火经连接酶连接修复，即为体外重组cccDNA分子模型。2.一种利用噬菌体单链制备技术体外重组HBV cccDNA分子模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、构建重组质粒，载体质粒插入部分λ噬菌体基因组，并构建入Ⅰ类脱氧核酶序列、Ⅱ类脱氧核酶序列和正负链全长乙型肝炎病毒HBV基因组序列；S2、制备单链形式cccDNA，将步骤S1构建的重组质粒转化入大肠杆菌并用VCSM13辅助噬菌体进行感染，包装出基因组上含有HBV全长序列的噬菌体，抽提M13噬菌体基因组并引入Zn
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切割后，获得单链形式的HBV cccDNA；S3、体外重组HBV cccDNA，将步骤S2获得的HBV cccDNA正负链退火经连接酶连接修复，即为体外重组HBV cccDNA分子模型。3.权利要求2所述的一种利用噬菌体单链制备技术体外重组HBV cccDNA分子模型的方法，其特征在于，步骤S1中，HBV序列5
’
端插入I类脱氧核酶，I类脱氧核酶所产生的疤痕序列5
’‑
AG
‑3’
两碱基与HBV单链序列前两个碱基重叠。4.权利要求2所述的一种利用噬菌体单链制备技术体外重组HBV cccDNA分子模型的方法，其特征在于，步骤S1中，HBV序列3
’
端插入Ⅱ类脱氧核酶。5.如权利要求2所述的一种利用噬菌体单链制备技术体外重组HBV cccDNA分子模型的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁正宏，陈捷亮，李雨檬，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：