一种大豆耐旱性基因的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种大豆耐旱性基因的应用，属于基因工程技术领域。本发明专利技术为解决目前大豆作物受到高温、干旱等环境导致的胁迫，影响大豆产量的问题。所述大豆耐旱性基因为GmCYP704C1，所述GmCYP704C1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明专利技术通过转基因技术增加GmCYP704C1基因在所述大豆中的表达量，以此改善大豆的耐旱性能，提高国产大豆的产量和耐逆能力。逆能力。

【技术实现步骤摘要】
一种大豆耐旱性基因的应用


[0001]本专利技术涉及一种大豆耐旱性基因的应用，属于基因工程


技术介绍

[0002]干旱是威胁全球作物产量的重要非生物胁迫因子之一。大豆是一种重要的豆类作物，具有巨大的经济意义，但其产量高度依赖于适宜的降雨或者充足的灌溉。干旱胁迫对大豆渗透调节、生长形态和产量等方面的有着重要影响。我国北方地区，容易受到高温、干旱等环境导致的胁迫，影响大豆产量。陆生植物表面覆盖有角质层，由疏水物质角质和蜡质组成，通过调控角质层合成，可实现作物抗旱遗传改良，然而大豆角质层合成机制还鲜见报道。因此，通过调控角质层合成提高大豆抗旱能力对于大豆高产具有重要意义。

技术实现思路

[0003]本专利技术提供一种大豆耐旱性基因的应用方法，以此改善大豆的耐旱性能，提高国产大豆的产量和耐逆能力。
[0004]本专利技术提出技术方案如下：
[0005]一种基因，所述基因名称为GmCYP704C1，所述GmCYP704C1基因的序列如SEQ IDNo.1所示。
[0006]一种重组载体，所述重组载体含有权利要求1所述的GmCYP704C1基因，并采用pCAMBIA1300作为中间载体构建获得。
[0007]一种重组菌，所述重组菌含有上述GmCYP704C1基因，并采用上述的重组载体转化至农杆菌获得。
[0008]进一步限定，所述农杆菌为农杆菌EHA105。
[0009]一种基因在提高大豆耐旱性能中的应用，所述基因为上述GmCYP704C1基因。
[0010]进一步限定，提高大豆耐旱性能的方法为增加大豆GmCYP704C1基因的表达量。
[0011]GmCYP704C1基因在大豆抗逆品种育种中的应用，其具体育苗方法为：
[0012](1)将挑选的受试品种DN50大豆种子进行消毒；
[0013](2)将DN50大豆种子接种于萌发培养基上，封口后放入光照培养箱进行培养；
[0014](3)将重组菌菌液进行活化得到工程菌液；
[0015](4)将萌发好的种子与工程菌液进行侵染与共培养，得到共培养后的外植体；
[0016](5)将共培养后的外植体诱导其生芽、芽伸长以及生根，得到再生苗；
[0017](6)将生长状态良好、根长达到2cm的再生苗移栽至装有蛭石和土壤的花盆中；
[0018](7)筛选抗性苗。
[0019]本专利技术提供了一种具有抗性形状的基因，通过转基因技术得到大豆抗逆新材料，提高大豆在干旱环境中的适应性，保证大豆产量和质量。
附图说明
[0020]图1为GmCYP704C1基因过表达大豆PCR验证，M代表Maker，WT代表野生型，1、2、3代表GmCYP704C1基因过表达大豆不同株系；
[0021]图2为GmCYP704C1基因过表达大豆qPCR验证，纵坐标代表GmCYP704C1基因表达水平，横坐标WT代表野生型，OV#1、OV#2代表GmCYP704C1基因过表达大豆不同株系；
[0022]图3为GmCYP704C1基因编辑大豆T7酶切鉴定，M代表Maker，1
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9是不同转化事件的T7酶切检验，两条带的是编辑的转化事件；2、3、8是成功编辑转化事件；其余没有成功编辑；
[0023]图4为GmCYP704C1基因编辑大豆测序鉴定，绿色框代表GmCYP704C1基因原始序列，红色框代表编辑位点和类型(片段插入/缺失)；
[0024]图5为非生物胁迫下GmCYP704C1基因表达量分析，纵坐标代表叶片中GmCYP704C1基因的表达量，横坐标代表胁迫处理0h、0.5h、1h、3h、6h、12h；
[0025]图6为GmCYP704C1基因过表达大豆表现抗旱；
[0026]图7为干旱处理后大豆的存活率，纵坐标代表存活率，横坐标WT代表野生型，OV#1、OV#2代表GmCYP704C1基因过表达大豆不同株系；
[0027]图8为干旱处理前后GmCYP704C1基因的表达模式，纵坐标代表相对表达量，横坐标代表不同时期不同组织部位：V4
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第4个片三出复叶长出；R1
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始花期；R5
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始粒期；root：根，stem：茎，leaf：叶，flower：花，pod：荚；seed：种子；
[0028]图9为GmCYP704C1基因过表达导致角质成分变化，纵坐标代表角质单体相对含量，横坐标代表不同种类角质单体：C12 acid：12烷酸，C14 acid：14烷酸，C16acid：16烷酸，C18 acid：18烷酸，C22 acid：22烷酸，C24 acid：24烷酸，C18:1acid：含一个不饱和键十八酸，C18:2acid：含2个不饱和键十八酸，C18:3acid：含3个不饱和键十八酸，C16acid 16OH：侧链加羟基16烷酸，C16：1acid 16OH：含一个不饱和键，侧链加羟基16烷酸，C18：1acid18OH：含一个不饱和键，侧链加羟基18烷酸；
[0029]图10为GmCYP704C1蛋白Western blot；
[0030]图11为CO差异光谱法验证GmCYP704C1活性；
[0031]图12为GmCYP704C1促进角质层密度降低大豆叶片渗透性，(a)为V4时期大豆叶片上表皮角质层的TEM图像；(b)为通过TEM图片用ImageJ统计分析叶片角质层厚度；(d)为通过0.05％甲苯胺蓝37℃浸泡2分析叶片角质层渗透性；(e)为通过微蒸腾室分析叶片角质层渗透性。
具体实施方式
[0032]本专利技术所用的试剂、仪器或设备等如无特殊说明书均可通过商业化途径购买获得，涉及的实验方法利用试剂盒进行的均按照试剂盒操作实施，其他方法如无特殊说明，均为常规分子生物学实验操作。
[0033]实施例1目的基因的克隆和植物表达载体的构建
[0034]使用东农50品种植株叶片提取大豆RNA，并进行反转录获得cDNA，反转录获得cDNA作为扩增模板。反应体系如下：
[0035][0036]整个加样过程在冰上进行，并在通风橱中操作。
[0037]反应程序为：42℃，30min；85℃，5s。所得样品保存于
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80℃冰箱中。
[0038]通过Phytozome查询GmCYP704C1基因序列信息，并用Primer5.0软件设计基因扩增引物，对目的基因进行PCR扩增，预期产物大小为1530bp。引物如下：GmCYP704C1
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F:GAGCTGATGCCATCCTTGACTTTCCTT，(如SEQ ID No.2所示)GmCYP704C1
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R:CACCATATCCCTGTATCTGTGGAATGCC(如SEQ ID No.3所示)。将PCR获得目的基因片段，通过胶回收试剂盒回收纯化。然后，用BamHI和XbaI(NEB)消化PCR产物和pCAMBIA1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因，其特征在于，所述基因名称为GmCYP704C1，所述GmCYP704C1基因的序列如SEQ ID No.1所示。2.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求1所述的GmCYP704C1基因，并采用pCAMBIA1300作为中间载体构建获得。3.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌含有权利要求1所述的GmCYP704C1基因，并采用权利要求2所述的重组载体转化至农杆菌获得。4.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于，所述农杆菌为农杆菌EHA105。5.一种基因在提高大豆耐旱性能中的应用，其特征在于，所述基因为权利要求1中所述的GmCYP704C1基因。6.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：柏锡，马晓飞，周静文，董悦，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：