2,4-DNT生物降解相关八个基因的结构优化与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种优化后适用于植物表达的2,4

【技术实现步骤摘要】
2,4
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DNT生物降解相关八个基因的结构优化与应用


[0001]本专利技术属于基因工程领域，具体涉及结构优化的2,4
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DNT生物降解相关八个基因的序列。

技术介绍

[0002]硝基芳香污染物二硝基甲苯（2,4
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dinitrotoluene, 2,4
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DNT）是生产炸药TNT的前体，同时也是生产农药，塑料以及汽车安全气囊的一类重要化工产品。工业生产中广泛应用2,4
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DNT导致其不可避免的泄露到环境中，从而对环境造成污染。常规污染物修复的方法主要包括物理修复和化学修复，其成本较高，设备复杂且修复效率较低。而植物修复则成本较低，能够原位修复土壤，且对环境破坏较小，因此具有广泛的应用前景。然而由于植物自身缺乏能够将2,4
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DNT降解的特异酶，因此限制了植物修复的效率。
[0003]利用合成生物学和代谢工程的方法将来源于细菌中的代谢途径转入植物中能够赋予植物原来不具有的功能。利用这一方法可以构建出能够适用于修复2,4
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DNT的工程植物。目前已经在微生物中发现能够将2,4
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DNT完全降解的途径：2,4
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DNT双加氧酶(编码基因为dntAaAbAcAd)和4
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甲基
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硝基酚(4M5NC)单加氧酶(编码基因为dntB)分别负责芳香环的羟基化和硝基取代基的消除。2,4,5
‑ꢀ
THT加氧酶(编码基因为dntD)和双功能异构酶/水解酶(dntG编码)催化甲基丙二酸三聚醛(MAS)和丙酮酸的生成。最后，辅酶A (CoA)依赖的甲基丙二酸半醛脱氢酶(dntE编码)催化甲基丙二酸三聚醛(MAS)生成丙酰辅酶A。
[0004]由于微生物中降解2,4
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DNT路径五个酶可以将2,4
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DNT最终降解为丙酮酸和丙酰辅酶A，而丙酮酸和丙酰辅酶A均为对植物无毒物质。因此成功实现这一代谢途径的在植物中异源表达对于植物修复2,4
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DNT具有重要的意义及应用潜力。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题在于提供能够在植物中表达的2,4
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DNT完全降解相关八个基因的优化重组与应用：dntAaS基因：编码2,4
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DNT双加氧酶a亚基dntAbS基因：编码2,4
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DNT双加氧酶b亚基dntAcS基因：编码2,4
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DNT双加氧酶γ亚基dntAdS基因：编码2,4
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DNT双加氧酶δ亚基dntBS基因：编码4
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甲基
‑5‑
硝基酚(4M5NC)单加氧酶dntDS基因：编码2,4,5
‑ꢀ
THT加氧酶dntGS基因：编码双功能异构酶/水解酶dntES基因：编码甲基丙二酸半醛脱氢酶2,4
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DNT经过五步酶促反应生成丙酮酸和丙酰辅酶A。为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案来实现：本专利技术中基因序列基于Burkholderiacepacia中的8个基因。本专利技术只保留每个基
因的编码序列，并分别连接上独立的CaMV35S启动子和终止子调控其表达。同时优化编码区基因结构，遵循以下原则：（一）优化基因密码子，提高基因翻译效率。（二）消除基因内部的常用限制性内切酶的识别位点，便于表达盒构建。（三）消除逆向重复序列、茎环结构和转录终止信号，使基因内部的GC/AT均衡，提高RNA的稳定性。（四）使基因编码蛋白符合N端原则，以提高翻译蛋白的稳定性。（五）优化mRNA二级结构自由能，以提高基因表达效率。
[0006]上述经优化的2,4
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DNT降解相关的八个基因的核苷酸序列如SEQIDNo1、
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SEQIDNo8所示。每个基因两端分别边上CaMV35S启动子与终止子，完整序列两端分别连接SacI,XhoI,BamHI,SalI,HindIII,EcoRI,XbaI,KpnI,DpnI酶切位点，全长序列由生工生物工程（上海）股份公司合成（参见图1）。将合成的基因片段经SacI,XhoI,BamHI,SalI,HindIII,EcoRI,XbaI,KpnI,DpnI双酶切后，连入相同酶切的载体pCAMBIA1301，得到重组质粒，并经过农杆菌介导的方法将其转化水稻，得到阳性株系。阳性水稻植株种植在100毫升水培液中，加入20mg/L的2,4
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DNT，经过10天生长，阳性工程水稻能够将2,4
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DNT完全降解。
[0007]有益效果：本专利技术优化并合成了2,4
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DNT降解相关八个基因，并能在水稻中成功表达，阳性水稻植株能够完全降解培养基中的2,4
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DNT。在废水处理和环境修复等领域具有应用潜力。
[0008]附图说明：图1为用于在大肠杆菌中表达邻苯二酚降解相关八个基因的载体示意图。
[0009]图2为转2,4
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DNT降解模块的工程水稻的DNA检测电泳图。
[0010]图3转2,4
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DNT降解模块的工程水稻生长在含有2,4
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DNT的营养液中，利用高效液相色谱(HPLC)检测营养液中2,4
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DNT的残留量具体实施方式：以下结合附图详细描述本专利技术的技术方案。实施例仅用以说明本专利技术的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施对本专利技术进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对专利技术的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本专利技术的技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本专利技术的权利要求范围中。
[0011]本专利技术涉及分子生物学实验，如没有特别注明，均参考自《分子克隆》一书（J.萨姆布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994，科学出版社）。所用水稻种子（日本晴）由上海市农业科学院生物技术研究所植物基因工程研究室保存，本专利技术所用的试剂若未经说明，均购自生工生物工程（上海）股份公司或上海国药集团有限公司。
[0012]实施例12,4
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DNT降解相关八个基因的优化设计与合成将来源于Burkholderiacepacia的八个基因dntAaS、dntAbS、dntAcS、dntAdS、dntBS、dntDS、dntGS和dntES的编码序列，按以下原则：（一）优化基因密码子，兼顾植物的密码子偏爱，提高基因翻译效率。（二）消除基因内部的常用限制性内切酶的识别位点，便于表达盒构建。（三）消除逆向重复序列、茎环结构和转录终止信号，使基因内部的GC/AT均衡，提高RNA的稳定性。（四）使基因编码蛋白符合N端原则，以提高翻译蛋白的稳定性。（五）优化mRNA二级结构自由能，以提高基因表达效率。每个基因两端分别边上CaMV35S启动子与终止子，完整序列两端分别连接SacI,XhoI,BamH本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.人工优化后的2,4
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DNT利用相关的八个基因，其特征在于，这八个基因的核苷酸序列分别如SEQ ID No 1
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SEQ ID No 8所示。2.根据权利要求1所述的八个基因的核苷酸序列，其特征在于，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No 9
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SEQ ID No...

【专利技术属性】
技术研发人员：高建杰，姚泉洪，彭日荷，田永生，王波，李振军，许晶，韩红娟，王丽娟，付晓燕，邓永东，王宇，张文慧，左志豪，钱岑，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：