一种卵形鲳鲹半胱氨酸双加氧酶ToCDO基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种卵形鲳鲹半胱氨酸双加氧酶ToCDO基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。还公开了含有上述卵形鲳鲹半胱氨酸双加氧酶ToCDO基因编码的蛋白，表达载体、重组菌株和重组蛋白，以及上述基因、蛋白、表达载体、重组菌株和重组蛋白在催化L

【技术实现步骤摘要】
一种卵形鲳鲹半胱氨酸双加氧酶ToCDO基因及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种卵形鲳鲹半胱氨酸双加氧酶ToCDO基因及其应用。

技术介绍

[0002]半胱氨酸双加氧酶(Cysteine dioxygenase,CDO)是一种硫醇双加氧酶，近年来，CDO基因已经从从细菌到哺乳动物的各种物种中克隆出来。对各纯化重组蛋白的研究已经有些进展，确定了其具有严格的底物特异性，并证实CDO需要亚铁辅因子的活性。在生理作用方面，普遍认为CDO在半胱氨酸水平的稳态调节和氧化代谢物中发挥重要作用。
[0003]CDO是杯状蛋白超家族的一个成员。该超家族包括许多功能多样的包括辅酶结合蛋白、甘露聚糖
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磷酸酯异构酶和水解酶，磷酸异构酶和羟基花青素二氧酶。该家族的成员拥有一个三明治状的中央结构域具有果冻卷的拓扑结构和两个主要的共识序列，被称为杯状蛋白1(cupin motif 1)(GX5HXHX3,4EX6G)和状蛋白2(cupin motif 2)(GX5PXGX2HX3N)，二者之间有一个15
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50个氨基酸的间隔。
[0004]卵形鲳鲹(Trachinotusovatus)，鲳鲹属，主要分布于亚太地区，由于其肉质鲜美，容易饲养，营养价值高等一系列优点，养殖经济效益显著，已成为我国华南沿海地区一种重要的海水养殖鱼类，养殖年产量能够达到16万吨以上，然而随着鱼粉价格的增长导致饲料中过多的植物蛋白替代时，饲料中将缺乏牛磺酸，导致卵形鲳鲹生长性能下降；饲料中牛磺酸的缺乏成为了如今导致卵型鲳鯵生长性能下降的主要因素之一。虽然随着饲料配方的研发和完善，目前饲养的卵形鲳鲹存活率和生长性能得到了初步提高。但是，现存的各种饲料都只能缓解鱼粉缺乏所带来的影响，并不能使得卵形鲳鲹完全适应植物蛋白替代鱼粉导致的牛磺酸缺乏。因此，从卵形鲳鲹自身出发，分析提高其自身牛磺酸合成能力，也是解题的一种新思路。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的第一个技术问题是一种卵形鲳鲹半胱氨酸双加氧酶ToCDO基因及其编码的蛋白。
[0006]本专利技术所要解决的第二个技术问题是提供一种包含所述卵形鲳鲹半胱氨酸双加氧酶ToCDO基因的表达载体或重组菌株及其制备方法。
[0007]本专利技术所要解决的最后一个技术问题是提供上述的卵形鲳鲹半胱氨酸双加氧酶ToCDO基因、上述蛋白、上述表达载体、上述述重组菌株或上述方法制备的重组卵形鲳鲹半胱氨酸双加氧酶CDO蛋白在催化L
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半胱氨酸生成L
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半胱亚磺酸中的应用以及在体外制备半胱亚磺酸产品中的应用。
[0008]为解决上述第一个技术问题，本专利技术提供了一种卵形鲳鲹半胱氨酸双加氧酶ToCDO基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]本专利技术还提供了上述卵形鲳鲹半胱氨酸双加氧酶ToCDO基因编码的蛋白，其氨基
酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0010]为解决上述第二个技术问题，本专利技术提供了一种表达载体，包含所述卵形鲳鲹半胱氨酸双加氧酶ToCDO基因。
[0011]作为本专利技术一种优选的实施方式，所述表达载体为pET
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30a
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ToCDO。
[0012]本专利技术还提供了一种重组菌株，包含所述的卵形鲳鲹半胱氨酸双加氧酶ToCDO基因。
[0013]优选的，所述重组菌株由上述的表达载体转化寄主细胞，形成含有卵形鲳鲹半胱氨酸双加氧酶ToCDO基因的重组菌株。
[0014]作为本专利技术的一种优选的实施方式，所述寄主细胞为大肠杆菌BL21，所述重组菌株为pET
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30a/ToCDO
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BL21。
[0015]本专利技术还提供了一种制备重组卵形鲳鲹半胱氨酸双加氧酶ToCDO蛋白的方法，利用所述表达载体转化寄主细胞，培养转化体，得到重组菌株，再将重组菌株培养至对数期后分离纯化，得到重组卵形鲳鲹半胱氨酸双加氧酶ToCDO蛋白。
[0016]为解决上述最后一个技术问题，本专利技术提供了上述卵形鲳鲹半胱氨酸双加氧酶ToCDO基因、上述蛋白、上述表达载体、上述重组菌株或上述方法制备的重组卵形鲳鲹半胱氨酸双加氧酶ToCDO蛋白在催化L
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半胱氨酸生成L
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半胱亚磺酸中的应用。
[0017]进一步的，本专利技术还提供了上述卵形鲳鲹半胱氨酸双加氧酶ToCDO基因、上述蛋白、上述表达载体、上述重组菌株或上述方法制备的重组卵形鲳鲹半胱氨酸双加氧酶ToCDO蛋白在体外制备L
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半胱亚磺酸产品中的应用。
[0018]与现有技术相比，本专利技术的具有以下优点：
[0019]本专利技术以工程菌重组表达的方式获得半胱氨酸双加氧酶蛋白，该蛋白体外催化生成L
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半胱亚磺酸过程简单易于合成，具有较高催化活性，酶活为227.23195U，有效提高了催化效率，为L
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半胱亚磺酸的生物合成提供了新的高效方法。
附图说明
[0020]下面参照附图结合实施例对本专利技术作进一步的描述。
[0021]图1为实施例1中卵形鲳鲹半胱氨酸双加氧酶基因的测序峰图；
[0022]图2为实施例1中卵形鲳鲹ToCDO cDNA序列和氨基酸序列，起始密码子和终止密码子用方框标出，糖基化位点用下划线标出，丝氨酸位点用蓝色突出字体标出，苏氨酸位点用绿色突出字体标出，络氨酸位点红色突出字体标出；CDO和cupin结构域分别用阴影和波浪线标出；
[0023]图3为实施例1中卵形鲳鲹ToCDO氨基酸多序列比对；
[0024]图4为实施例1中卵形鲳鲹ToCDO系统进化树；
[0025]图5为实施例2中pET30a
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ToCDO酶切图；
[0026]图6为实施例3中SDS
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PAGE分析ToCDO蛋白于BL21(DE3)表达情况；
[0027]图7为实施例3中SDS
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PAGE分析卵形鲳鲹ToCDO蛋白上清纯化结果；
[0028]图8为实施例3中卵形鲳鲹ToCDO蛋白WB检测结果；
[0029]图9为实施例4中HPLC测定对照组CSA标准溶液的高效液相图；
[0030]图10为实施例4中HPLC测定实验组半胱氨酸亚磺酸的高效液相图。
具体实施方式
[0031]下面对本专利技术的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本专利技术，但并不构成对本专利技术的限定。此外，下面所描述的本专利技术各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
[0032]下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0033]下述实施方法中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规实验方法。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均与本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种卵形鲳鲹半胱氨酸双加氧酶ToCDO基因，其特征是：其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.权利要求1所述的卵形鲳鲹半胱氨酸双加氧酶ToCDO基因编码的蛋白，其特征是：其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。3.一种表达载体，其特征是：包含权利要求1所述卵形鲳鲹半胱氨酸双加氧酶ToCDO基因。4.一种重组菌株，其特征是：包含权利要求1所述的卵形鲳鲹半胱氨酸双加氧酶ToCDO基因。5.权利要求4所述重组菌株的制备方法，其特征是：所述重组菌株由权利要求3所述的表达载体转化寄主细胞，形成含有卵形鲳鲹半胱氨酸双加氧酶ToCDO基因的重组菌株。6.根据权利要求5所述重组菌株的制备方法，其特征是：所述寄主细胞为大肠杆菌BL21，所述重组菌株为pET
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30a/ToCDO
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BL21。7.一种制备重组卵形鲳...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁俊杰，张殿昌，朱克诚，郭华阳，刘宝锁，张楠，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院南海水产研究所，
类型：发明
国别省市：