一种谷氨酸脱羧酶及其基因和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种谷氨酸脱羧酶及其基因和应用，谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列为SEQ ID No.4，为一种谷氨酸脱羧酶突变体。谷氨酸脱羧酶突变体的最适反应温度为55℃，最适反应pH为pH 5.0，T

【技术实现步骤摘要】
一种谷氨酸脱羧酶及其基因和应用


[0001]本专利技术涉及酶工程
，具体涉及一种谷氨酸脱羧酶及其基因和应用。

技术介绍

[0002]γ
‑
氨基丁酸(GABA)是一种非蛋白天然氨基酸，具有降血压、利尿、改善睡眠、抗抑郁等多种重要的生理功能，在医药、食品及化妆品等领域应用前景广阔。生物法合成GABA不受资源、环境和空间等限制，是研究的一个主要方向。谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase,GAD；EC 4.1.1.15)是生物法合成GABA的关键限速酶，其能够专一、不可逆地催化L
‑
谷氨酸(或L
‑
谷氨酸盐)脱去α
‑
羧基生成GABA并释放出CO2。获取具有良好催化性能的谷氨酸脱羧酶是实现生物法高效合成GABA的重要前提。
[0003]目前，来源于乳酸乳球菌、嗜热链球菌、屎肠球菌、植物乳杆菌、短促生乳杆菌、清酒乳杆菌、保加利亚乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、布氏乳杆菌、大肠杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌、巨大芽孢杆菌、米曲霉、绿色木霉及少孢根霉等不同微生物染色体上的GAD基因已被克隆和异源表达，但随后的酶学性质研究显示，天然的GAD普遍存在热稳定性差和催化活性低的缺陷。为此，包括国内外研究者通过拉氏图信息、脯氨酸效应、蛋白质表面电荷优化、结构域增减、序列一致性等方法在一定程度上提升了GAD的催化性能，但生物法合成GABA在工业应用中，仍受到谷氨酸脱羧酶热稳定性差、以及活性与热稳定性不兼容等问题的制约。
[0004]近年来，来源于大肠杆菌(PDB IDs.1XEY,3FZ6,3FZ7,3FZ8,2DGK,1PMO)与短促生乳杆菌(原短乳杆菌，PDB ID.5GP4)的微生物源GAD晶体结构模型先后被解析，这为GAD的“结构
‑
功能”关系提供了重要的信息。如何在提升谷氨酸脱羧酶热稳定性的同时、强化其对底物的亲和力并进一步提高其催化活性，具有重要的研究意义和价值。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中存在的上述技术问题，本专利技术提供一种谷氨酸脱羧酶及其基因和应用，具有良好的热稳定性、底物亲和力和催化活性。
[0006]本专利技术公开了一种谷氨酸脱羧酶，所述谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列为SEQ ID No.4。
[0007]优选的，氨基酸序列的获取方法包括：
[0008]获取短促生乳杆菌谷氨酸脱羧酶的野生型氨基酸序列；
[0009]固定野生型氨基酸序列的多个位点；
[0010]基于祖先酶序列重建方法，构建所述野生型氨基酸序列的祖先酶进化树；
[0011]根据所述祖先酶进行树，获得所述谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列。
[0012]优选的，所述位点包括以下氨基酸位点的组合：
[0013]F65,K89,C130,G164,Q166,W169,I178,M185,I211,T215,D246,A248,T254,L267,H278,K279和P285。
[0014]优选的，谷氨酸脱羧酶的制备方法包括：根据所述氨基酸序列，获得相应的基因序
列；合成并扩增所述基因序列；根据所述基因序列以及表达载体，构建重组质粒；根据所述重组质粒以及宿主，构建工程菌或工程细胞；利用工程菌或工程细胞表达重组蛋白；从表达重组蛋白的工程菌或工程细胞中分离纯化谷氨酸脱羧酶。
[0015]优选的，构建工程菌的方法包括：
[0016]设计第一引物对和第二引物对，其中第一引物对为：gadB
1413
‑
F1和gadB
1413
‑
R1，第二引物对为gadB1413
‑
F2和gadB1413
‑
R2；
[0017]分别以第一引物对和第二引物对，扩增所述基因序列，获得第一序列和第二序列；
[0018]利用限制性内切酶Nde I和Sal I分别处理载体pET28a和纯化后的第一序列，获得双酶切pET28a和双酶切第一序列；通过T4
‑
DNA连接酶，连接所述双酶切pET28a和双酶切第一序列，获得第一质粒；将所述第一质粒导入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，获得第一工程菌；
[0019]利用限制性内切酶Nco I和Kpn I分别处理载体pNZ8149和纯化后的第二序列，获得双酶切pNZ8149和双酶切第二序列；通过T4
‑
DNA连接酶，连接所述双酶切pNZ8149和双酶切第二序列，获得第二质粒；将所述第二质粒导入L.lactis NZ3900感受态细胞中，获得第二工程菌。
[0020]优选的，所述谷氨酸脱羧酶的最适反应温度为55℃，最适反应pH为pH5.0，T
5015
为59.1℃，60℃条件下的半衰期t
1/2
为25.6分钟，对底物L
‑
谷氨酸的米氏常数为26.80mM，催化效率为2.14s
‑1mM
‑1。
[0021]本专利技术还提供上述谷氨酸脱羧酶的基因序列。优选的，所述基因为SEQ IDNo.2。
[0022]本专利技术还提供一种上述谷氨酸脱羧酶的应用，用于催化L
‑
谷氨酸或L
‑
谷氨酸盐脱去α
‑
羧基生成γ
‑
氨基丁酸。
[0023]优选的，基于谷氨酸脱羧酶突的氨基酸序列构建的工程菌经诱导表达后，用于催化L
‑
谷氨酸或L
‑
谷氨酸盐脱去α
‑
羧基生成γ
‑
氨基丁酸。
[0024]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：具有良好的热稳定性、底物亲和力和催化活性。
附图说明
[0025]图1是野生型谷氨酸脱羧酶与谷氨酸脱羧酶突变体的一致性分析图；
[0026]图2是重组载体的示意图和双酶切琼脂糖凝胶电泳图；
[0027]图3是突变体可溶性表达的电流图；
[0028]图4是突变体催化的最初反应速率图；
[0029]图5是不同温度下的催化活性分析图；
[0030]图6是不同pH的催化活性分析图；
[0031]图7是不同温度条件下孵育15min后相对活性的分析图(T
5015
)；
[0032]图8是在60℃条件下孵育不同时间后的相对活性分析图(t
1/2
)；
[0033]图9是游离工程菌的催化性能分析图；
[0034]图10本专利技术的谷氨酸脱羧酶的制备方法流程图。
具体实施方式
[0035]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种谷氨酸脱羧酶，其特征在于，所述谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列为SEQ ID No.4。2.根据权利要求1所述的谷氨酸脱羧酶，其特征在于，氨基酸序列的获取方法包括：获取短促生乳杆菌谷氨酸脱羧酶的野生型氨基酸序列；固定野生型氨基酸序列的多个位点；基于祖先酶序列重建方法，构建所述野生型氨基酸序列的祖先酶进化树；根据所述祖先酶进行树，获得所述谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列。3.根据权利要求2所述的谷氨酸脱羧酶，其特征在于，所述位点包括以下氨基酸位点的组合：F65,K89,C130,G164,Q166,W169,I178,M185,I211,T215,D246,A248,T254,L267,H278,K279和P285。4.根据权利要求1所述的谷氨酸脱羧酶，其特征在于，谷氨酸脱羧酶的制备方法包括：根据所述氨基酸序列，获得相应的基因序列；合成并扩增所述基因序列；根据所述基因序列以及表达载体，构建重组质粒；根据所述重组质粒以及宿主，构建工程菌或工程细胞；利用工程菌或工程细胞表达重组蛋白；从表达重组蛋白的工程菌或工程细胞中分离纯化谷氨酸脱羧酶。5.根据权利要求4所述的谷氨酸脱羧酶，其特征在于，构建工程菌的方法包括：设计第一引物对和第二引物对，其中第一引物对为：gadB
1413
‑
F1和gadB
1413
‑
R1，第二引物对为gadB1413
‑
F2和gadB1413
‑
R2；分别以第一引物对和第二引物对，扩增所述基因序列，获得第一序列和第二序列；利用限制性内切酶Nde I和Sal I分别处理载体pET28a和纯化后的第一序列，获得双酶切pET28a和双酶切第一序列；通过T4
‑
DNA连接酶，连接所...

【专利技术属性】
技术研发人员：王东阳，孔建彪，戈连峰，吕常江，陈正，
申请(专利权)人：山东阳成生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：