一种β-法尼烯合成酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种β

【技术实现步骤摘要】
一种
β
‑
法尼烯合成酶突变体及其应用


[0001]本专利技术属于蛋白质工程改造和工程菌
，具体涉及一种β
‑
法尼烯合成酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]法尼烯(Farnesene)是植物产生的一种天然倍半萜，包括α
‑
法尼烯(3,7,11
‑
三甲基
‑
1,3,6,10
‑
十二碳四烯)和β
‑
法尼烯(7,11
‑
二甲基
‑3‑
亚甲基
‑
1,6,10
‑
十二碳三烯)两种异构体，最早在苹果皮中被分离鉴定出来，在自然界中是各种植物精油的主要成分，例如Mentha haplocalyx Briq、Chrysanthemum coronarium L、Solanum tuberosum L等。法尼烯常温状态下呈微粘的油状液体，且易挥发，不溶于水，可溶于烃类有机溶剂。随着人们对其结构和功能的认识，其应用领域越来越广泛，包括农业、工业、生物能源等方面，体现了其优良的特性和巨大的应用潜力。
[0004]可通过植物中提取、化学合成和微生物发酵合成获得法尼烯。由于法尼烯在植物中的含量比较低，且植物的生长受到季节、地域、气候等因素的影响较大，从植物中提取法尼烯的成本高，难以稳定的满足市场需求；也有研究以橙花叔醇、法尼醇、月桂烯或香叶基溴和丁烯醇为原料，用化学法合成法尼烯，但是原料的可获取性、成本、生产效率、环境污染等也是化学合成法无法避免的问题；微生物发酵法因其克服了天然提取和化学合成的弊端，成为获得法尼烯的最佳生产方式。
[0005]萜类合成酶的活性通常是微生物异源合成萜类的限制因素。萜类合成酶的周转率通常低于0.5/s，这意味着其催化效率处于较低的水平，因此提高法尼烯合成酶的催化活性是保障高产量法尼烯的关键因素。

技术实现思路

[0006]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供一种β
‑
法尼烯合成酶突变体及其应用。本专利技术首先使用蛋白质工程对β
‑
法尼烯合成酶AanFS进行了半理性设计，采用同源建模，使用分子对接和分子动力学模拟并计算出有利于提高其活性的突变体，经实验验证后得到多个活性提高的位点并组合突变，并得到的最优突变体AanFS
K197T/F180H
使β
‑
法尼烯产量较野生型提高了283.8％，极大地提高了其活性。同时利用基因工程技术获得表达该β
‑
法尼烯合成酶突变体的解脂耶氏酵母菌株Q26菌株，该菌株能够利用油酸为碳源，经高密度培养后，β
‑
法尼烯产量达到35.2g/L；利用厨余用油为碳源，β
‑
法尼烯产量达到31.9g/L，是高产β
‑
法尼烯的优良菌株。基于上述研究成果，从而完成本专利技术。
[0007]具体的，本专利技术涉及以下技术方案：
[0008]本专利技术的第一个方面，提供一种β
‑
法尼烯合成酶突变体，所述β
‑
法尼烯合成酶突
变体选自下组的一个或多个位点发生突变：F180H、E184H、K197T、L326I、L326V、N332L和R482L，其中，氨基酸残基编号采用SEQ ID NO.2(野生型β
‑
法尼烯合成酶的氨基酸序列)所示的编号。
[0009]所述β
‑
法尼烯合成酶突变体在SEQ ID NO.2所示的β
‑
法尼烯合成酶基础上进行突变，突变位点具体为K197T和F180H的组合。本专利技术通过研究发现，在所有的突变体中，K197T/F180H突变体(AanFS
K197T/F180H
)表现出最佳的活性，使β
‑
法尼烯产量较野生型AanFS提高了283.8％。
[0010]本专利技术的第二方面，提供一种多聚核苷酸分子，所述多聚核苷酸分子编码上述第一方面所述的β
‑
法尼烯合成酶突变体。
[0011]本专利技术的第三方面，提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体含有本专利技术第二方面所述的多聚核苷酸分子。
[0012]本专利技术的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本专利技术第三方面所述的载体、染色体整合有本专利技术第二方面所述的多聚核苷酸分子或者表达第一方面所述β
‑
法尼烯合成酶突变体。上述宿主细胞具有高产β
‑
法尼烯的能力。
[0013]所述宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞。
[0014]所述宿主细胞是细菌细胞、真菌细胞或植物细胞中的任意一种或多种。
[0015]以解脂耶氏酵母菌株(Yarrowia lipolytica)Po1f作为出发菌株，通过基因工程技术，获得一株解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Q26，所述菌株已于2022年8月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：中国武汉.武汉大学，其生物保藏号为：CCTCC NO:M 20221274。
[0016]本专利技术的第五方面，提供培养上述宿主细胞的方法，所述方法包括：将所述宿主细胞置于培养基中进行培养。
[0017]所述培养基可以是任意适于细菌细胞、真菌细胞或植物细胞进行培养的培养基。
[0018]本专利技术的第六方面，提供一种菌剂，所述菌剂包含上述细菌细胞、真菌细胞或其发酵物或其代谢产物，特别是解脂耶氏酵母Q26或其发酵物或其代谢产物；特别的，所述菌剂中含有β
‑
法尼烯合成酶突变体。
[0019]本专利技术的第七方面，提供了产β
‑
法尼烯的方法，所述方法包括利用上述β
‑
法尼烯合成酶突变体进行催化合成β
‑
法尼烯的过程；或，
[0020]利用发酵底物培养上述宿主细胞，并分离提取β
‑
法尼烯的过程。
[0021]本专利技术的第八方面，提供上述第一方面所述β
‑
法尼烯合成酶突变体、第二方面所述多聚核苷酸分子、第三方面所述重组表达载体、第四方面所述宿主细胞、第五方面所述培养方法、第六方面所述菌剂、第七方面所述产β
‑
法尼烯的方法在化妆品、农业、工业和生物能源等领域中的应用。
[0022]本专利技术的第九方面，提供一种上述β
‑
法尼烯合成酶突变体的获得方法，所述获得方法包括：
[0023]使用蛋白质工程技术对β
‑
法尼烯合成酶AanFS(其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)进行了半理性设计；由于目前尚未报道关于法尼烯合成酶三维结构的信息，本专利技术中采用同源建模的方法本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种β
‑
法尼烯合成酶突变体，其特征在于，所述β
‑
法尼烯合成酶突变体选自下组的一个或多个位点发生突变：F180H、E184H、K197T、L326I、L326V、N332L和R482L，其中，氨基酸残基编号采用SEQ ID NO.2所示的编号。2.一种多聚核苷酸分子，其特征在于，所述多聚核苷酸分子编码权利要求1所述的β
‑
法尼烯合成酶突变体。3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有权利要求2所述多聚核苷酸分子；优选的，所述重组表达载体通过权利要求2所述多聚核苷酸分子有效地连接到表达载体上获得。4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求3所述重组表达载体、染色体整合有权利要求2所述多聚核苷酸分子或者表达权利要求1所述β
‑
法尼烯合成酶突变体；所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞；所述宿主细胞是细菌细胞、真菌细胞或植物细胞中的任意一种或多种；所述细菌细胞包括埃希氏菌属、农杆菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属、假单胞菌属或葡萄球菌属内的任何种；所述细菌细胞为大肠杆菌、根癌农杆菌、发根农杆菌、乳酸乳球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和荧光假单胞菌；所述植物包括黄花蒿植株、拟南芥植株、玉米植株、高粱植株、马铃薯植株、番茄植株、小麦植株、油菜植株、油菜籽植株、大豆植株、水稻植株、大麦植株和烟草植株；所述真菌细胞包括酵母菌；所述酵母菌被修饰为与内源活性相比，具有甲羟戊酸合成途径的过氧化物酶体和细胞质共同定位，具有增强的权利要求1所述β
‑
法尼烯合成酶突变体(包括AanFS
K197T/F180H
)和代谢途径全部基因及β
‑
氧化基因POT1所编码酶的活性，同时具有缺失DGA1和DGA2而减弱的脂肪酸代谢；所述酵母菌为解脂耶氏酵母；以解脂耶氏酵母菌株(Yarrowia lipolytica)Po1f作为出发菌株，通过基因工程技术，获得一株解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Q26，该菌株已于2022年8月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，其生物保藏号为：CCTCC NO:M20221274。5.培养权利要求4所述宿主细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：将所述宿主细胞置于培养基中进行培养；所述培养基是任意适于细菌细胞、真菌细胞或植物细胞进行培养的培养基；当所述真菌解脂耶氏...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯进，张瑾，祁庆生，刘营航，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：