一种桃色杆菌JZB09、褐藻胶裂解酶rAly06925及该酶的编码基因与应用制造技术

本发明专利技术涉及一种桃色杆菌(Persicobacter sp.)JZB09保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏日期2021年4月12日，保藏编号CCTCC M 2021354；并提供了一种来源于桃色杆菌JZB09的褐藻胶裂解酶rAly06925，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述褐藻胶裂解酶rAly06925的编码基因aly06925，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1，该褐藻胶裂解酶rAly06925能够降解褐藻胶或褐藻胶寡糖生产非还原末端含有ΔM的系列富含G不饱和寡糖片段。不饱和寡糖片段。不饱和寡糖片段。

【技术实现步骤摘要】
一种桃色杆菌JZB09、褐藻胶裂解酶rAly06925及该酶的编码基因与应用
[0001]本专利技术为申请号：202110476331.2、申请日2021.04.29、专利技术名称“一种桃色杆菌JZB09、褐藻胶裂解酶rAly06925及该酶的编码基因与应用”的分案申请。


[0002]本专利技术涉及一种桃色杆菌JZB09、褐藻胶裂解酶rAly06925及该酶的编码基因与应用，属于生物


技术介绍

[0003]褐藻胶是由β
‑
D
‑
甘露糖醛酸(β
‑
D
‑
Mannuronate,M)和α
‑
L
‑
古洛糖醛酸(α
‑
L
‑
Guluronate,G)两种糖单元通过β
‑
1,4糖苷键随机链接而成的线性阴离子多糖，且M和G在C5位上互为差向异构体
[1]。褐藻胶主要产自海带、马尾藻、墨角藻和巨藻等大型褐藻的细胞壁和细胞质间质中
[2]。此外，条件致病菌铜绿假单胞菌和某些土壤微生物如棕色固氮菌也能分泌褐藻胶
[3,4]，区别在于微生物来源的褐藻胶具有乙酰化修饰
[5]。褐藻胶无毒无害，在食品行业里可用于清除体内重金属离子
[6]和提高冰激凌的粘稠度
[7]，也可用于医药行业里的止血纱布、止血剂和绷带
[8]及药物包埋材料
[9]。褐藻胶与琼胶、卡拉胶一起，是产量最大、经济价值最高、应用最为广泛的三大海洋多糖。长期以来，褐藻胶的高值化研究一直是海洋生物
的重点之一。已有研究表明褐藻胶寡糖使白血病细胞U973的细胞核形态发生改变从而导致细胞凋亡
[10]，实现对白血病细胞U973的抑制作用。此外，最新研究表明由聚M段褐藻胶寡糖制备的“甘露寡糖二酸(GV971)”能抑制β
‑
淀粉样蛋白沉淀、细胞毒性和细胞的聚集
[11]，可用于治疗轻度、中度阿尔兹海默症(Alzheimer Disease,AD)。因此，具有特定M/G比例和聚合度大小的褐藻胶寡糖具有重要应用价值和经济价值，实现这类寡糖的高效制备具有重要意义。
[0004]褐藻胶裂解酶是一类多糖裂解酶(Polysaccharide Lyase,PL)，通过β消去反应催化糖苷键的断裂，并在寡糖产物的非还原性末端形成C4＝C5不饱和双键，与C5
‑
位的C＝O(羧羰基)形成共轭结构，从而产生含有不饱和末端(Δ)的寡糖产物并在232nm附近具有特征吸收
[12]。褐藻胶裂解酶的来源非常广泛，包括土壤微生物、海洋藻类、海洋软体动物、棘皮动物及多种体表或体内共生的海洋微生物，其中细菌是褐藻胶裂解酶的主要来源
[13,14]。然而，受限于天然褐藻胶裂解酶的产量低，转基因褐藻胶裂解酶虽然产量高、但多数酶的水溶性和活性较差等综合因素的影响，迄今，关于酶的底物选择性、底物降解模式与寡糖生成特性的研究较少，仅见G
‑
专一性内切酶Aly5
[15]、M
‑
专一性内切酶Pae
‑
AlgL和Avi
‑
AlgL
[16]、G
‑
倾向性内切酶Aly1
[17]和Aly2
[18]等报道。因此整体上不能提供充足的酶学特性信息，导致工具酶匮乏且无法精确应用。尤其在工业上，内切型褐藻胶裂解酶是高效制备系列褐藻胶寡糖产物的工具酶。
[0005]专利技术人的已有研究重点围绕内切型褐藻胶裂解酶进行了分析，并重点阐述了一系列内切型褐藻胶裂解酶的底物选择性、底物降解模式和寡糖生成特性，并通过归纳总结，发
现是酶的底物选择性和底物降解模式共同决定了内切酶的寡糖生成特性。已发现寡糖终产物结构特征具有ΔM向ΔG或ΔG向ΔM的演替规律的褐藻胶内切酶
[15
‑
18]、专产ΔG末端的富含G片段的单糖外切褐藻胶裂解酶
[19]及专产ΔM末端的富含G片段的PL8家族以褐藻胶为最适底物的M
‑
专一性广谱多糖降解酶
[20]，但目前未见Persicobacter菌株来源的褐藻胶裂解酶、特性与应用价值的报道，尤其专产ΔM末端终产物的褐藻胶内切酶。

技术实现思路

[0006]本专利技术针对现有技术的不足，提供了一种桃色杆菌JZB09、褐藻胶裂解酶rAly06925及该酶的编码基因与应用。
[0007]下面内容中Δ为不饱和单糖、X是指G或M；所述M为β
‑
1,4
‑
D
‑
甘露糖醛酸，G为α
‑
1,4
‑
L
‑
古罗糖醛酸。
[0008]褐藻胶裂解酶rAly06925简称“rAly06925”。
[0009]该酶能专一性降解来自褐藻胶的甘露糖醛酸寡糖片段，是M
‑
专一型褐藻胶裂解酶。因此推测降解褐藻胶时专一性降解富含M的片段，即M
‑
MMXn、G
‑
MMXn、Δ
‑
MMXn(n≥1，且为自然数；X为G或M)，并高效切割其中
‑
所示糖苷键位置，从而生成非还原末端仅为ΔM的系列不饱和寡糖终产物。因此rAly06925是目前首次报道的专产仅含ΔM末端的内切型褐藻胶裂解酶。据此，可用于彻底降解褐藻胶多糖或寡糖以专一性制备以ΔM为非还原性末端的富含G的系列不饱和寡糖片段。此外，深入探讨该酶其系列突变体对酶活的影响，确定了潜在催化基序为N
238
‑
N
239
‑
H
240
‑
G
241
‑
T
242
‑
H
243
，且Y
87
，Q
170
，H
240
，Y
295
等是关键的催化位点残基。特别的，截除rAly06925的额外肽段K
45
‑
N
60
(即T45
‑
60N，为截除氨基酸序列中从45位到60位的氨基酸)或将Y
244
突变为除芳香烃氨基酸外的其他氨基酸均导致重组蛋白丧失水溶性，因此额外肽段K
45
‑
N
60
及所含Y
244
残基对维持蛋白质构象或决定蛋白质表面的亲水性具有关键作用。
[0010]本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0011]一种桃色杆菌(Persicobacter sp.)JZB09保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏日期2021年4月12日，保藏编号CCTCC M2021354。
[0012]“桃色杆菌(Persicobacter 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种来源于桃色杆菌(Persicobacter sp.)JZB09的褐藻胶裂解酶rAly06925，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；优选的，所述褐藻胶裂解酶rAly06925的编码基因aly06925，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；优选的，一种重组表达载体Ⅰ，包含所述褐藻胶裂解酶rAly06925的编码基因aly06925；优选的，一种重组菌Ⅰ，包含所述褐藻胶裂解酶rAly06925的编码基因aly06925。2.权利要求1所述褐藻胶裂解酶rAly06925的编码基因aly06925、重组表达载体Ⅰ、重组菌Ⅰ在制备褐藻胶裂解酶rAly06925中的应用；优选的，权利要求1所述褐藻胶裂解酶rAly06925在降解褐藻胶或褐藻胶寡糖中的应用；优选的，权利要求1所述褐藻胶裂解酶rAly06925在降解褐藻胶或褐藻胶寡糖生产非还原末端含有ΔM的系列富含G不饱和寡糖片段的应用；优选的，权利要求1所述褐藻胶裂解酶rAly06925在降解褐藻胶或褐藻胶寡糖生产不饱和二糖的应用。3.一种褐藻胶裂解酶rAly06925突变酶，其特征在于，氨基酸突变位点为氨基酸序列SEQ IDNO.2的第48位氨基酸由酪氨酸变为丙氨酸；优选的，所述褐藻胶裂解酶rAly06925突变酶的编码基因，根据所述氨基酸的突变位点在编码基因SEQ ID NO.1上进行定点突变；优选的，一种重组表达载体Ⅱ，包含所述突变酶的编码基因；优选的，一种重组菌Ⅱ，包含所述突变酶的编码基因。4.权利要求3所述褐藻胶裂解酶rAly06925突变酶的编码基因、重组表达载体Ⅱ、重组菌Ⅱ在制备褐藻胶裂解酶rAly06925突变酶中的应用；优选的，权利要求3所述褐藻胶裂解酶rAly06925突变酶在降解褐藻胶或褐藻胶寡糖中的应用；优选的，权利要求3所述褐藻胶裂解酶rAly06925突变酶在降解褐藻胶或褐藻胶寡糖生产非还原末端含有ΔM的系列富含G不饱和寡糖片段的应用。5.一种褐藻胶裂解酶rAly06925突变酶，其特征在于，氨基酸突变位点为氨基酸序列SEQ IDNO.2的第53位氨基酸由异亮氨酸变为丙氨酸、第52位氨基酸由苯丙氨酸变为丙氨酸、第115位氨基酸由组氨酸变为丙氨酸、第118位氨基酸由苯丙氨酸变为丙氨酸、第119位氨基酸由天冬酰胺变为丙氨酸或者第243位氨基酸由组氨酸变为丙氨酸；优选的，所述褐藻胶裂解酶rAly06925突变酶的编码基因，根据所述氨基酸的突变位点在编码基因SEQ ID NO.1上进行定点突变；优选的，一种重组表达载体Ⅲ，包含所述突变酶的编码基因；优选的，一种重组菌Ⅲ，包含所述突变酶的编码基因。6.权利要求5所述褐藻胶裂解酶rAly06925突变酶的编码基因、重组表达载体Ⅲ、重组菌Ⅲ在制备褐藻胶裂解酶rAly06925突变...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩文君，曾良欢，王延辉，李俊鸽，古静燕，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：