一种透明质酸裂解酶及其重组菌与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种透明质酸裂解酶及其重组菌与应用。本发明专利技术提供了一种来源于弗氏柠檬酸杆菌的透明质酸裂解酶，克隆了其编码基因并在大肠杆菌体系实现了重组表达，经过启动子优化后酶活为2.64

【技术实现步骤摘要】
一种透明质酸裂解酶及其重组菌与应用


[0001]本专利技术涉及一种透明质酸裂解酶及其重组菌与应用，属于酶工程


技术介绍

[0002]透明质酸是一类糖胺聚糖，由重复的葡萄糖醛酸和N
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乙酰氨基葡萄糖二糖单位组成，其具有的亲水性、粘弹性与生物相容性使其被广泛关注并应用于医药、美妆、食品等领域。透明质酸裂解酶(HA lyase)可通过β消除断裂其β
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1，4糖苷键，降解为小分子透明质酸，在透明质酸加工、医药、发酵工业等领域应用广泛。
[0003]体内和体外实验证明，透明质酸的生物活性与其链长和分子量密切相关。低分子量透明质酸一般指相对分子质量在10
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50kDa之间的透明质酸，而相对分子质量小于10kDa的透明质酸片段通常被归为透明质酸寡糖。与高分子量透明质酸不同，低分子量透明质酸与透明质酸寡糖具有独特的生物活性，如促进血管生成、抗氧化、抗炎等，因此在医药领域有着潜在的应用价值。此外，随着对透明质酸寡糖研究的深入，实验发现含不同二糖单元数量的透明质酸寡糖具有不同的生物学功能，如不饱和透明质酸二糖展现出独特的抗炎活性。因此，制备特定分子量的透明质酸有着重要意义。
[0004]目前，透明质酸的降解方法主要包括物理降解、化学降解和生物酶降解。其中，通过物理处理很难将透明质酸降解至10kDa以下；化学方法能够制备透明质酸寡糖，但其弊端在于其需要苛刻的反应条件，并有可能引入不必要的副反应，如糖链中单糖残基结构的破坏。相比之下，酶降解透明质酸更环保，反应迅速且条件更温和。
[0005]当前，商品化透明质酸酶主要来自动物组织提取，存在资源有限、比活力低、稳定性差等问题。相比之下，微生物来源的透明质酸裂解酶表现出更高活力与更强的稳定性，在低分子量透明质酸与透明质酸寡糖制备中具有良好的应用潜力。

技术实现思路

[0006]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种透明质酸裂解酶以及表达透明质酸裂解酶的重组菌株及应用。
[0007]本专利技术的第一个目的是提供一种透明质酸裂解酶，所述透明质酸裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]本专利技术的第二个目的是提供编码所述透明质酸裂解酶的基因。
[0009]进一步地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]本专利技术的第三个目的是提供一种携带所述基因的表达载体。
[0011]进一步地，所述表达载体以质粒pET
‑
3b(+)为载体。
[0012]本专利技术的第四个目的是提供一种表达所述透明质酸裂解酶的重组菌。
[0013]进一步地，所述重组菌是以大肠杆菌为宿主，将grpE启动子、fnr启动子或alsR启动子与T7启动子串联，以串联启动子调控所述透明质酸裂解酶的表达。
[0014]进一步地，所述大肠杆菌为大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)。
[0015]本专利技术的第五个目的是提供一种采用所述重组菌发酵生产透明质酸裂解酶的方法，包括如下步骤：
[0016]将所述重组菌接种至发酵培养基中，在发酵过程中，pH维持在7.0～8.0，溶氧维持在20％以上。
[0017]进一步地，所述发酵培养基中包括18～22g/L甘油，且其中蛋白胨与酵母粉质量比为1.5～2.5：1。
[0018]进一步地，所述发酵培养基包括18～22g/L甘油，22～26g/L蛋白胨，10～14g/L酵母粉，0.15～0.20M KH2PO4与0.70～0.75M K2HPO4，pH为7.0～8.0。
[0019]本专利技术的第六个目的是提供所述透明质酸裂解酶在降解透明质酸中的应用。
[0020]进一步地，所述透明质酸为高分子量透明质酸，分子量为1000～1500kDa。
[0021]进一步地，所述应用是将高分子量透明质酸降解为低分子量透明质酸或寡糖。
[0022]进一步地，降解透明质酸的条件为：反应温度25
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37℃、反应pH 5
‑
7、搅拌速度50
‑
100rpm、透明质酸浓度15
‑
20g/L。
[0023]本专利技术的有益效果是：
[0024]本专利技术提供了一种来源于弗氏柠檬酸杆菌的透明质酸裂解酶，克隆了其编码基因并在大肠杆菌体系实现了重组表达，经过启动子优化后酶活为2.64
×
104U/mL，蛋白分子量为87kDa。酶学性质表征实验表明其为内切酶，能够在pH 5
‑
8范围内发挥透明质酸降解作用，最适反应pH为5.5，最适反应温度为37℃。该酶具有良好的热稳定性，pH稳定性与耐盐性，可以耐受1.5M的氯化钠溶液。该酶对透明质酸有着较高的底物特异性。探究了基于产透明质酸裂解酶重组菌的发酵与罐上放大工艺。优化的培养基含20g/L甘油，24g/L蛋白胨，12g/L酵母粉，0.17M KH2PO4与0.72M K2HPO4，pH为7.5。利用优化的培养基，在5
‑
L发酵罐中，重组菌产透明质酸裂解酶的最高活性在14h可达2.65
×
106U/mL。
附图说明：
[0025]图1为PCR扩增透明质酸裂解酶编码基因与线性化载体pET
‑
3b(+)的核酸电泳图谱。(a)泳道1
‑
2为扩增得到的透明质酸裂解酶编码基因；泳道M：10,000bp DNAMarker。(b)泳道1为反向PCR扩增得到的线性化载体pET
‑
3b(+)；泳道M：10,000bp DNAMarker。
[0026]图2为pET
‑
3b(+)
‑
HylC质粒构建成功后的菌落PCR验证核酸电泳图。泳道1为重组菌菌落PCR扩增得到的携带目的基因的基因片段；泳道M：5,000bp DNA Marker。
[0027]图3为重组菌E.coli BL21(DE3)/pet
‑
3b(+)
‑
HylC与经过纯化的透明质酸裂解酶HylC的SDS
‑
PAGE图谱。泳道1
‑
2：E.coli BL21(DE3)/pet
‑
3b(+)
‑
HylC菌株破碎上清、HylC纯酶；泳道M：蛋白标准Marker。
[0028]图4为重组质粒的启动子替换(a)、启动子串联(b)结果示意图。
[0029]图5为HylC的最适反应温度(a)、温度稳定性(b)、最适反应pH(c)、pH稳定性(d)、耐盐性(e)以及金属离子对HylC酶活的影响(f)。
[0030]图6为HylC的底物特异性(a)、对不同浓度底物的酶解曲线(b)、酶动力学参数的双倒数作图(c)。
[0031]图7为100U/mL HylC对透明质酸降解1h(a)、3h(b)、6h(c)时的透明质酸寡本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种透明质酸裂解酶，其特征在于，所述透明质酸裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.编码权利要求1所述透明质酸裂解酶的基因。3.根据权利要求2所述基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.一种携带权利要求2或3所述基因的表达载体。5.一种表达权利要求1所述透明质酸裂解酶的重组菌。6.根据权利要求5所述重组菌，其特征在于，所述重组菌是以大肠杆菌为宿主，将grpE启动子、fnr启动子或alsR启动子与T7启动子串联，以串联启动子调控所述透明质酸裂解酶的表达。7.一种采用所述重组菌发酵生产透明质酸裂解酶的方法，包括如下步骤：将所述重组菌接种至发酵培养基中，在发酵过程中...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚劲松，张岳升，史劲松，许正宏，李恒，苏畅，江佳宇，廉少杰，康传利，刘磊，郑德强，
申请(专利权)人：山东焦点福瑞达生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：