一种醛缩酶生物元件筛选方法的构建与应用技术

本发明专利技术公开一种醛缩酶生物元件筛选方法以及将系列醛缩酶用于催化甲醛与丙酮酸缩合反应合成4

【技术实现步骤摘要】
optimized methanol assimilation pathway relying on promiscuous formaldehyde
‑
condensing aldolases in E.coli,HaiHe,PhilippeMarli
è
re,ArrenBar
‑
Even.MetabEng,2020.60:1
‑
13)。在该途径中，甲醛可以和糖酵解终端产物丙酮酸进行非天然醛缩反应生成4
‑
羟基2
‑
酮丁酸。4
‑
羟基2
‑
酮丁酸是生物制造中的一种重要中间体，可进一步合成多种高附加值化学品，包括高丝氨酸、3
‑
羟基丙酸，1,3
‑
丙二醇等(Combining Aldolases and Transaminases for the Synthesis of 2
‑
Amino
‑4‑
hydroxybutanoic Acid,Karel Hernandez,JordiBujons,Jesus Joglar,Simon J.Charnock,Pablo Dom
í
nguez de Mar
í
a,Wolf Dieter Fessner,and PereClapes.ACSCatal,2017.7(3):1707
‑
1711；An Aldolase
‑
Catalyzed New Metabolic Pathway for the Assimilation of Formaldehyde and Methanol To Synthesize2
‑
Keto
‑4‑
hydroxybutyrate and 1,3
‑
Propanediol in Escherichia coli,Chuang Wang,Jie Ren,Libang Zhou,Zhidong Li,Lin Chen,An
‑
Ping Zeng.ACS Synth.Biol.2019.8：2483
‑
2493)。相较于天然利用途径，甲醛非天然利用途径具有简短、高效优势，因此成为甲醇、甲烷、甲醛等微生物一碳利用的研究热点方向。
[0004]在一碳利用方面，甲醛和丙酮酸的非天然缩合反应，已展现出极大的应用潜力。但目前报道的能够有效催化甲醛与丙酮酸缩合反应的醛缩酶非常少，主要包括2
‑
酮
‑4‑
羟基戊二酸醛缩酶(KHB，EC 4.1.3.16)，2
‑
脱氢
‑3‑
脱氧
‑
L
‑
鼠李糖酸醛缩酶(RhmA,也命名为YfaU,EC 4.1.2.53)和5
‑
酮
‑
4脱氧
‑
D
‑
戊二酸醛缩酶(GarL,EC 4.1.2.20)等。同时已报道的醛缩酶普遍对甲醛亲和力不高，表现出较低的催化活性，因此限制了甲醛非天然利用途径的应用。

技术实现思路

[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术将提供一种高效挖掘、筛选醛缩生物材料的方法策略，成功筛选了一些列能够有效催化甲醛与丙酮酸缩合生成4
‑
羟基
‑2‑
酮丁酸的新型醛缩酶。为解决甲醛利用奠定酶元件基础。
[0006]本专利技术的一个目的提供一种醛缩酶生物元件的应用，所述应用是以丙酮酸与甲醛为底物，生物合成4
‑
羟基
‑2‑
酮丁酸以及4
‑
羟基
‑2‑
酮丁酸下游衍生物，其中所述醛缩酶能够以甲醛与丙酮酸为底物，生物合成4
‑
羟基
‑2‑
酮丁酸；所述醛缩酶生物元件为如下B1或B2或B3：
[0007]B1、醛缩酶，B2、编码所述醛缩酶的核酸序列，B3、含有所述核酸序列的表达盒、重组载体或重组微生物；
[0008]所述醛缩酶为如下C1
‑
C12任一种：
[0009]C1、序列表中序列1所示的蛋白；
[0010]C2、序列表中序列2所示的蛋白；
[0011]C3、序列表中序列3所示的蛋白；
[0012]C4、序列表中序列4所示的蛋白；
[0013]C5、序列表中序列5所示的蛋白；
[0014]C6、序列表中序列6所示的蛋白；
[0015]C7、序列表中序列7所示的蛋白；
[0016]C8、序列表中序列8所示的蛋白；
[0017]C9、序列表中序列9所示的蛋白；
[0018]C10、序列表中序列10所示的蛋白；
[0019]C11、将C1
‑
C10任一所述蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到具有相同功能的蛋白质；
[0020]C12、C1
‑
C10任一所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
[0021]将上述C12中的标签用于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化等。蛋白标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白。
[0022]所述标签可为下表中所示的标签中的任一：
[0023]表1融合表达蛋白标签
[0024]标签残基序列Poly
‑
His2
‑
10(通常为6个)HHHHHHPoly
‑
Arg5
‑
6个(通常为5个)RRRRRFlag8DYKDDDDKc
‑
myc10EQKLISEEDLStrep
‑
tag II8WSHPQFEKMBP367序列10
[0025]上述用醛缩生物材料催化甲醛与丙酮酸缩合生成4
‑
羟基
‑2‑
酮丁酸应用中(相应也提供了一种4
‑
羟基
‑2‑
酮丁酸或4
‑
羟基
‑2‑
酮丁酸下游衍生物的制备方法)；
[0026]进一步的，B3所述的核酸分子的表达盒是指能够在宿主细胞中表达上述醛缩酶DNA，该DNA不但可包括启动醛缩酶编码基因转录的启动子，还可包括醛缩酶编码基因转录的终止子。更进一步的，所述表达盒还可包括增强子序列。
[0027]B3所述的核酸分子的重组载体可为携带有所述醛缩酶编码基因的细菌质粒(如在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体，具体如pET
‑
16b、pET28a等；在细菌中表达的基于Trc启动子的表达载体，具体如pTrc99a、pTrc33a等)、噬菌体、酵母质粒或逆转录病毒包装质粒。
[0028]B3所述的含有编码上述脱氢酶的核酸分子的重组本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种醛缩酶生物元件的应用，所述应用是以丙酮酸与甲醛为底物，生物合成4
‑
羟基
‑2‑
酮丁酸以及4
‑
羟基
‑2‑
酮丁酸下游衍生物，所述醛缩酶属于HpcH功能域家族蛋白，数据库功能注释为可催化或注释推测可催化丙酮酸与乙醛缩合反应的蛋白，氨基酸序列长度范围为240
‑
320；能够以甲醛与丙酮酸为底物，生物合成4
‑
羟基
‑2‑
酮丁酸；所得醛缩酶生物元件为如下B1或B2或B3：B1、醛缩酶，B2、编码所述醛缩酶的核酸序列，B3、含有所述核酸序列的表达盒、重组载体或重组微生物；所述醛缩酶为如下C1
‑
C12任一种：C1、序列表中序列1所示的蛋白；C2、序列表中序列2所示的蛋白；C3、序列表中序列3所示的蛋白；C4、序列表中序列4所示的蛋白；C5、序列表中序列5所示的蛋白；C6、序列表中序列6所示的蛋白；C7、序列表中序列7所示的蛋白；C8、序列表中序列8所示的蛋白；C9、序列表中序列9所示的蛋白；C10、序列表中序列10所示的蛋白；C11、将C1
‑
C10任一所述蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加 得到具有相同功能的蛋白质；C12、C1
‑
C10任一所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；所述标签选自：Poly
‑
His、Poly
‑
Arg、Flag、c
‑
myc、Strep
‑
tag II、MBP。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：通过重组微生物或体外酶反应方法进行。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述重组微生物为将重组载体导入宿主菌中得到的重组菌，过表达产生所述的醛缩酶，参与甲醛与丙酮酸缩合反应合成4
‑
羟基
‑2‑
酮丁酸；所述重组载体为将权利要求1中所述醛缩酶的编码核酸序列插入表达载体中得到的载体。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述体外酶反应的体系包含权利要求1中的任一醛缩酶，其中醛缩酶参与甲醛与丙酮酸缩合反应合成4
‑
羟基
‑2‑
酮丁酸。5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述甲醛是直接作为底物。6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述甲醛以甲醇、肌氨酸、二氧化碳为底物，通过在重组微生物或体外酶反应体系中生成;优选地，所述重组微生物选自大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamnicum）、谷草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、乳酸菌（Lactic acid bacteria）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）、甲基营养菌（Methylorubrumextorquens）、酿酒酵母 (Saccharomyces cer...

【专利技术属性】
技术研发人员：李梁坡，杨晨，董红军，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：