一种酶活提高的谷氨酸脱羧酶突变体构建及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种酶活提高的谷氨酸脱羧酶突变体及其构建方法，属于基因工程领域。本发明专利技术将源于巨大芽孢杆菌谷氨酸脱羧酶编码基因进行定点饱和突变，通过高通量筛选得到酶活力提升突变体，突变体的第467位组氨酸突变成丝氨酸。本发明专利技术得到的突变体在大肠杆菌中表达，谷氨酸脱羧酶突变体比酶活为176.31U/mg，提高42.7％，本发明专利技术表明467位氨基酸残基对酶的催化作用和稳定性有较大影响，对该酶的催化机理的研究提供了一定的基础，并提高了该酶的工业应用潜力。工业应用潜力。

【技术实现步骤摘要】
一种酶活提高的谷氨酸脱羧酶突变体构建及其应用


[0001]本专利技术涉及一种酶活提高的谷氨酸脱羧酶突变体构建及其应用，属于基因工程


技术介绍

[0002]γ
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氨基丁酸(GABA)是一种天然存在的功能性非蛋白质氨基酸，具有增进脑活力、降血压、抗焦虑、调节激素分泌、治疗癫痫和保肝护肾等生理功能，在食品、医药保健、饮料加工、化妆品等领域具有广泛的应用前景和市场需求。目前，γ
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氨基丁酸的制备方法主要有化学合成、微生物发酵和生物转化法等，但是化学合成法的成本高得率低且不能被用于食品、药品和饲料加工等领域，微生物发酵法生产周期长、生产得率较低且后续分离提取较为困难，使其工业化应用受到限制，而生物转化法由于具有操作简便、条件温和、原料利用率高、转化率高且分离纯化成本低等优势，越来越受到青睐。谷氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.15)是生物体内广泛存在的一种酶，能不可逆地催化L
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谷氨酸(盐)转化生成γ
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氨基丁酸，是生物转化法合成γ
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氨基丁酸的关键酶制剂，具有巨大的市场应用价值(Xu N,et al.Biotechnological advances and perspectives of gamma
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aminobutyric acid production.World J Microbiol Biotechnol.2017,33(3):64)。但是，目前国内外已报道的谷氨酸脱羧酶一般催化效率较低且酶活性范围偏酸性，这一特性严重影响了其在工业上的应用。
[0003]因此，获得具有优良催化性能的谷氨酸脱羧酶，并且开发制备γ
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氨基丁酸的新工艺，将是解决γ
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氨基丁酸高产问题的关键方法。利用定向进化及半理性设计等策略提高谷氨酸脱羧酶催化活性，对于提高谷氨酸脱羧酶工业化应用前景具有重要意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术在天然谷氨酸脱羧酶的基础上，通过定点饱和突变获得突变体文库，在通过高通量筛选方法进行筛选，得到酶活显著提升突变酶体，通过测序发现突变体酶的第467位组氨酸突变为丝氨酸，突变体酶的比酶活较突变前提高42.7％。
[0005]本专利技术首先提供一种谷氨酸脱羧酶突变体，对源于巨大芽孢杆菌的野生型谷氨酸脱羧酶进行定点突变得到；其是将467位组氨酸突变成丝氨酸，所述野生型谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0006]优选地，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0007]本专利技术提供所述突变体的编码基因。优选地，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3。
[0008]本专利技术进一步提供含有所述的基因的重组表达载体。优选地，其是原核表达载体，例如是大肠杆菌表达载体。
[0009]本专利技术还提供含有所述的编码基因或所述的重组表达载体的重组细胞。优选地，其是原核细胞，例如是大肠杆菌。
[0010]本专利技术最后还提供所述的突变体或其编码基因在生物合成γ
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氨基丁酸中的应
用。具体地，包括培养含有所述的编码基因的重组细胞以产生γ
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氨基丁酸，并收集所产生的γ
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氨基丁酸的步骤。
[0011]本专利技术表明467位氨基酸残基对酶的催化作用有较大影响，对该酶的催化机理的研究提供了一定的基础，由此获得的突变体提高了该酶的工业应用潜力。本专利技术所得可用于生物合成γ
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氨基丁酸。
具体实施方式
[0012]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利技术作进一步的详细说明，但并不应理解为对本专利技术的限制。实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为本领域技术人员所熟知的常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0013]实施例1谷氨酸脱羧酶饱和突变体质粒文库的构建
[0014]谷氨酸脱羧酶是生物催化L
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谷氨酸脱羧反应生成γ
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氨基丁酸的关键酶，但是目前国内外已报道的谷氨酸脱羧酶一般催化效率较低且酶活性范围偏酸性，这一特性严重影响了其在工业上的应用。目前，来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的谷氨酸脱羧酶的晶体结构已经得到解析(PDB ID:1PMO)，并鉴定出许多重要的催化位点和保守基序，其中C端组氨酸保守残基显著影响底物与催化活性位点的结合特性(孙磊,等.谷氨酸脱羧酶结构及催化机制的研究概述.微生物学通报,2020,47:2236
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2244.)。此外，文献报道也发现大肠杆菌谷氨酸脱羧酶的C端组氨酸残基会在在碱性条件下会通过空间构象抑制酶活性(Pennacchietti E,et al.Mutation of His465 alters the pH
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dependent spectroscopic properties of Escherichia coli glutamate decarboxylase and broadens the range of its activity toward more alkaline pH.J Biol Chem.2009,284:31587
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96.)。本专利技术人前述专利CN106566823B中记载了来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的谷氨酸脱羧酶具有优良的催化性能，在酸性条件下仍具有较高的酶活。基于同源序列比对和蛋白结构建模等策略，本专利技术人分析了来源于巨大芽孢杆菌谷氨酸脱羧酶序列，发现其C端组氨酸残基与大肠杆菌谷氨酸脱羧酶具有高度保守性(Liu Q,et al.Expression,characterization and mutagenesis of a novel glutamate decarboxylase from Bacillus megaterium.Biotechnol Lett.2016,38:1107
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13)，推测可通过定点突变C端组氨酸残基以便增强底物与活性位点的结合，进而有助于提高谷氨酸脱羧酶活性，因此最终确定巨大芽孢杆菌野生型谷氨酸脱羧酶序列SEQ ID NO.1中C端第467位组氨酸H为突变靶点。
[0015]SEQ ID NO.1：MPQWHPHREQKNLPDEFPVNPLFSRQGEVTIPRLRIGDQGMLPETAYQIIHDEIALDGNARLNLATF VTTWMEPDAKRLYGESFDKNMIDKDEYPQTAAIEERCVRILADLWNSPNPDTTMGVSTTGSSEACMLGGLALKRRWQKLRKSKGLSTDRPNIVFSSSVQVVWEKFANYWDVEPRYVNINPDHPYLDAEGVINAVDENTIGVVPILGVTYTGGYEPIAAIAKALDELQEKTGLDIPIHVDAASGGFIAPFL本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种谷氨酸脱羧酶突变体，其特征在于，对源于巨大芽孢杆菌的野生型谷氨酸脱羧酶进行定点突变得到；其是将467位组氨酸突变成丝氨酸，所述野生型谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。3.权利要求1或2所述突变体的编码基因。4.如权利要求3所述的编码基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.3。5.含有如权利要求3或4所述的基因的重组表达载体。6.如权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，其是原核表达载体，例...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘君，李梦雅，徐宁，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：