本发明专利技术公开了一种组氨醇磷酸氨基转移酶突变体、工程菌及应用，属于生物技术领域。组氨醇磷酸氨基转移酶基因来源于藤黄轮丝链霉菌菌株HY61，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。所述突变体是在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列第66位、第138位、第197位、第226位、第311位发生单突变或多位点突变获得的。本发明专利技术构建的组氨醇磷酸氨基转移酶突变体工程菌株，配合充氮保护和稳定剂的使用，有效提高了3‑吲哚丙酮酸的稳定性，产物浓度最高可达179.8mM，转化率大于89％，且原料廉价易得，生产工艺简单易行、生产成本较低，实现了高产率绿色生产3‑吲哚丙酮酸。
【技术实现步骤摘要】
一种组氨醇磷酸氨基转移酶突变体、工程菌及应用
本专利技术涉及组氨醇磷酸氨基转移酶突变体、工程菌及应用，属于生物
技术介绍
3-吲哚丙酮酸(IPA)是重要的中间体化合物，是制造3-吲哚乙酸(植物生长激素)、3-吲哚乙醇、DL-色氨酸及D-色氨酸等物质的关键前体，且自身也是神经系统的治疗药物，在农业、食品及医药领域具有广泛用途，应用前景广阔。传统化学法合成IPA需要耗用大量的碱和吡啶醛，价格昂贵，且反应条件苛刻、产物纯化繁琐、产率不高，副产物存在环境污染风险。利用L-氨基酸氧化酶氧化脱氨也是一种合成IPA的重要方法，但副产物过氧化氢会导致IPA的降解，收率及纯度均难以保证。专利CN200880104143.X利用大肠杆菌工程表达来源于雷氏普罗威登斯菌(Providenciarettgeri)AJ2770菌株的氨基酸氧化酶，转化L-色氨酸生产IPA，200mmol/L底物色氨酸反应体系中，IPA的最高浓度仅为129mM，且产物得率较低。转氨酶(Transaminase)又称氨基转移酶(Aminotransferase)，催化氨基和酮基之间的氨基转移转氨酶，可以利用廉价原料L-色氨酸通过转氨基作用生产IPA，反应过程中无需通氧，亦不产生破坏酮酸稳定性的副产物(如过氧化氢)，极具应用前景。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于提供一种产组氨醇磷酸氨基转移酶突变体、重组菌及其全细胞作为催化剂，用于3-吲哚丙酮酸的合成。本专利技术是通过如下技术方案实现的：本专利技术提供了一种组氨醇磷酸氨基转移酶突变体，组氨醇磷酸氨基转移酶基因来源于藤黄轮丝链霉菌菌株HY61(Streptomycesluteoverticillatus)CGMCC15060，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。所述突变体是在SEQIDNO：2所示氨基酸序列第66位、第138位、第197位、第226位、第311位发生单突变或多位点突变获得的。进一步，所述突变体为下列之一，第66位缬氨酸突变为异亮氨酸(hisC-V66I)、第138位天冬酰胺突变为谷氨酰胺(hisC-N138Q)、第197位丝氨酸突变为组氨酸(hisC-S197H)或第226位脯氨酸突变为苯丙氨酸及第311位精氨酸突变为酪氨酸(hisC-P226F-R311Y)的组氨醇磷酸氨基转移酶突变体，更优选突变体为hisC-P226F-R311Y。本专利技术还涉及一种所述组氨醇磷酸氨基转移酶突变体的编码基因。本专利技术提供含有所述编码基因的工程菌。本专利技术还提供一种所述组氨醇磷酸氨基转移酶突变体在催化L-色氨酸合成3-吲哚丙酮酸中的应用。进一步，所述的应用方法为以含组氨醇磷酸氨基转移酶突变体基因的工程菌经发酵离心收获的菌体细胞作为全细胞催化剂，以L-色氨酸为底物，以L-色氨酸摩尔浓度1.2倍的丙酮酸为氨基受体，加入25mg/L的辅酶磷酸吡哆醛，1g/L的稳定保护剂的转化体系中，氨水调节pH为7.5，通氮气驱氧，温度30～40℃的条件下反应生产3-吲哚丙酮酸。进一步，所述转化体系中，催化剂的用量以湿菌体重量计为10～40g/L，底物浓度为50～200mM，丙酮酸浓度为60～240mM。进一步，含组氨醇磷酸氨基转移酶突变体基因的工程菌按如下方法制备：将含组氨醇磷酸氨基转移酶突变体基因的重组大肠杆菌接入LB斜面培养基37℃培养12～18h；接1环斜面菌种于LB液体种子培养基，37℃、180r/min振荡培养4～10h；3L发酵罐中装入2.0L培养基，以体积比2～12％接种量将种子液接入发酵培养基，初始转速220r/min，初始通气流量为1.0L/min，随着菌体浓度增加调节转速与通气流量，以维持溶氧值在20～30％空气饱和度，用质量体积比为25％氨水调节pH值稳定在6.7，37℃培养4～12h后加入乳糖至终浓度为1～5g/L并降温至20～30℃诱导表达；发酵过程中流加500g/L的甘油溶液维持甘油浓度在5～10g/L发酵结束后10000r/min、4℃离心10min收集菌体，无菌生理盐水洗涤菌体两次，得组氨醇磷酸氨基转移酶突变体全细胞催化剂。进一步，所述的LB斜面培养基的成分及终浓度：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，氨苄西林100mg/L，琼脂20g/L，pH7.0～7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min；进一步，所述的LB液体种子培养基的成分及终浓度：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，氨苄西林100mg/L，pH7.0～7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min；进一步，所述的发酵培养基的成分及终浓度：甘油20g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉5g/L，MgSO42g/L，KH2PO412.5g/L，(NH4)2SO42g/L，柠檬酸1g/L，玉米浆干粉3g/L，CaCl21g/L，D-生物素20μg/L，pH6.7～7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。进一步，所述的稳定保护剂为亚硫酸钠、植酸中的一种或组合使用。本专利技术与现有技术相比的有益效果是：本专利技术采用易错PCR技术成功突变来源于藤黄轮丝链霉菌的组氨醇磷酸氨基转移酶并构建工程菌株，筛选到的突变体酶活较原始最高提高120％，并用于3-吲哚丙酮酸的酶法合成，通过充氮保护和稳定剂的配合使用，有效提高了3-吲哚丙酮酸的稳定性，产物浓度最高可达179.8mM，转化率最大可达89.9％。同时本专利技术所述的生产方法所使用的原料廉价易得，且生产工艺简单易行、生产成本较低。建立的全细胞转化体系，解决了化学法合成IPA的反应条件苛刻、且产物纯化繁琐、产率不高，副产物存在环境污染风险的问题及L-氨基酸氧化酶副产物过氧化氢对产物的破坏影响，实现了高产率绿色生产IPA。具体实施方式下面通过实施例来对本专利技术的技术方案做进一步解释，但本专利技术的保护范围不受实施例任何形式上的限制。实施例1：表达载体和工程菌构建根据藤黄轮丝链霉菌菌株HY61，生物保藏号为CGMCC15060(该菌株在申请日之前已经进行生物保藏并在专利2018100327172中公开)基因hisC序列(SEQIDNo.1)设计含有NcoI酶切位点的上游引物hisC-NcoI-F：5′-aaccatggcaatgacgcgattacacgagctcc-3′，和含有XhoI酶切位点的下游引物hisC-XhoI-R：5′-aactcgagtcaggcggccgccggtccggcg-3′，黑色斜体为酶切位点。利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取得到藤黄轮丝链轮丝菌基因组DNA，并以该基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系包括2×GCBufferI25μL，dNTPMix8μL，TaKaRaLATaq0.5μL，模板0.5μL，上下游引物各1.0μL，用ddH2O补足至50μL。PCR反应参数为：94℃1min，1个循环；94℃30s，60℃30s，72℃2min，30个循环；72℃延伸5mi本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种组氨醇磷酸氨基转移酶突变体，其特征在于组氨醇磷酸氨基转移酶基因来源于藤黄轮丝链霉菌菌株HY61，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述突变体是在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列第66位、第138位、第197位、第226位、第311位发生单突变或多位点突变获得的，具体突变为第66位缬氨酸突变为异亮氨酸、第138位天冬酰胺突变为谷氨酰胺、第197位丝氨酸突变为组氨酸或第226位脯氨酸突变为苯丙氨酸及第311位精氨酸突变为酪氨酸。/n
【技术特征摘要】
1.一种组氨醇磷酸氨基转移酶突变体，其特征在于组氨醇磷酸氨基转移酶基因来源于藤黄轮丝链霉菌菌株HY61，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，氨基酸序列如SEQIDNO:2所示；所述突变体是在SEQIDNO：2所示氨基酸序列第66位、第138位、第197位、第226位、第311位发生单突变或多位点突变获得的，具体突变为第66位缬氨酸突变为异亮氨酸、第138位天冬酰胺突变为谷氨酰胺、第197位丝氨酸突变为组氨酸或第226位脯氨酸突变为苯丙氨酸及第311位精氨酸突变为酪氨酸。
2.一种权利要求1所述组氨醇磷酸氨基转移酶突变体的编码基因。
3.含有权利要求2所述编码基因的工程菌。
4.权利要求1所述组氨醇磷酸氨基转移酶突变体在催化L-色氨酸合成3-吲哚丙酮酸中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的应用方法为以含组氨醇磷酸氨基转移酶突变体基因的工程菌经发酵离心收获的菌体细胞作为全细胞催化剂，以L-色氨酸为底物，以L-色氨酸摩尔浓度1.2倍的丙酮酸为氨基受体，加入25mg/L的辅酶磷酸吡哆醛，1g/L的稳定保护剂的转化体系中，氨水调节pH为7.5，通氮气驱氧，温度30～40℃的条件下反应生产3-吲哚丙酮酸。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于在转化体系中，催化剂的用量以湿菌体重量计为10～40g/L，底物浓度为50～200mM，丙酮酸浓度为60～240mM。
7.权利要求3所述的含组氨醇磷酸氨基转移酶突变体基因的工程菌的制备方法，其特征在于所述方法具体如下：将含组氨醇磷酸氨基转移酶突变体基因的重组大肠杆菌接入LB斜面培养基37℃培养12～1...
【专利技术属性】
技术研发人员：王东阳，廖佳伟，陈正，张娟，冯志彬，
申请(专利权)人：山东阳成生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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