谷氨酰胺转胺酶突变体及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程领域，具体涉及谷氨酰胺转胺酶突变体及其编码基因和应用。通过对氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的野生酶进行S2P、S23V、Y24N、R215A、K294L；S2P、S23V、Y24N、R215A、H289Y；或S23V、Y24N、R215A、K269D、H289Y定点突变获得所述突变体。三个突变酶的比活分别是野生酶MTG‑WT的1.9倍、2.4倍、1.4倍，热稳定性优于野生酶。

【技术实现步骤摘要】
谷氨酰胺转胺酶突变体及其编码基因和应用
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及谷氨酰胺转胺酶突变体及其编码基因和应用。
技术介绍
谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase，TG)能够催化蛋白质肽链中谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基与各种酰基受体发生酰基转移反应，是一种有效的蛋白质交联剂。TG广泛分布于人体、哺乳动物、植物和微生物等体内，其中，微生物的谷氨酰胺转胺酶(MicrobialTransglutaminase，MTG)由于具有低蛋白分子量、非Ca2+依赖性和较广的底物范围等较优的酶学性质，在食品工业、生物医药、组织工程、定点蛋白交联和同源抗体偶联药物的构建等行业均具有广泛的应用价值。对于一些应用，包括热塑性加工的挤压和热稳定微胶囊产生固定化酶，在较高的温度和较高的活性下进行交联反应更有利。因此，具有更高活性和热稳定性的突变体不仅有望在当前工艺中使用，而且有望扩大新应用的范围。谷氨酰胺转胺酶的分子改良方面主要集中在热稳定性机理研究及改良。现有关于谷氨酰胺转胺酶的热稳定性研究主要集中在单点突变，组合突变的研究偏少，对于毕赤酵母分泌重组MTG中发生蛋白降解的研究未见报道，减少分泌蛋白降解是否会影响酶活及热稳定性、影响机制是什么，这些问题均未见报道。
技术实现思路
基于已报道的谷氨酰胺转胺酶的热稳定性偏低、发酵过程目的蛋白易降解等问题，本专利技术提供了一种谷氨酰胺转胺酶突变体。本专利技术的目的是提供热稳定性和酶活提高的谷氨酰胺转胺酶突变体。本专利技术的再一目的是提供编码上述热稳定性和酶活提高的谷氨酰胺转胺酶突变体的基因。本专利技术的再一目的是提供包含上述基因的重组载体。本专利技术的再一目的是提供包含上述基因的重组菌株。本专利技术的再一目的是提供制备热稳定性和酶活提高的谷氨酰胺转胺酶的方法。本专利技术的再一目的是提供上述热稳定性和酶活提高的谷氨酰胺转胺酶突变体的应用。根据本专利技术的热稳定性和酶活提高的谷氨酰胺转胺酶突变体，所述突变体通过对氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的野生型谷氨酰胺转胺酶进行以下定点突变而得：S2P-S23V-Y24N-R215A-K294L；S2P-S23V-Y24N-R215A-H289Y；或S23V-Y24N-R215A-K269D-H289Y。SEQIDNO：1：DSDDRVTPPAEPLDRMPDPYRPSYGRAETVVNNYIRKWQQVYSHRDGRKQQMTEEQREWLSYGCVGVTWVNSGQYPTNRLAFASFDEDRFKNELKNGRPRSGETRAEFEGRVAKESFDEEKGFQRAREVASVMNRALENAHDESAYLDNLKKELANGNDALRNEDARSPFYSALRNTPSFKERNGGNHDPSRMKAVIYSKHFWSGQDRSSSADKRKYGDPDAFRPAPGTGLVDMSRDRNIPRSPTSPGEGFVNFDYGWFGAQTEADADKTVWTHGNHYHAPNGSLGAMHVYESKFRNWSEGYSDFDRGAYVITFIPKSWNTAPDKVKQGWP根据本专利技术的具体实施方式的突变体Mut1(S2P-S23V-Y24N-R215A-K294L)的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。SEQIDNO：2所示DPDDRVTPPAEPLDRMPDPYRPVNGRAETVVNNYIRKWQQVYSHRDGRKQQMTEEQREWLSYGCVGVTWVNSGQYPTNRLAFASFDEDRFKNELKNGRPRSGETRAEFEGRVAKESFDEEKGFQRAREVASVMNRALENAHDESAYLDNLKKELANGNDALRNEDARSPFYSALRNTPSFKERNGGNHDPSRMKAVIYSKHFWSGQDRSSSADKAKYGDPDAFRPAPGTGLVDMSRDRNIPRSPTSPGEGFVNFDYGWFGAQTEADADKTVWTHGNHYHAPNGSLGAMHVYESLFRNWSEGYSDFDRGAYVITFIPKSWNTAPDKVKQGWP根据本专利技术的具体实施方式的突变体Mut2(S2P-S23V-Y24N-R215A-H289Y)的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示。SEQIDNO：3：DPDDRVTPPAEPLDRMPDPYRPVNGRAETVVNNYIRKWQQVYSHRDGRKQQMTEEQREWLSYGCVGVTWVNSGQYPTNRLAFASFDEDRFKNELKNGRPRSGETRAEFEGRVAKESFDEEKGFQRAREVASVMNRALENAHDESAYLDNLKKELANGNDALRNEDARSPFYSALRNTPSFKERNGGNHDPSRMKAVIYSKHFWSGQDRSSSADKAKYGDPDAFRPAPGTGLVDMSRDRNIPRSPTSPGEGFVNFDYGWFGAQTEADADKTVWTHGNHYHAPNGSLGAMYVYESKFRNWSEGYSDFDRGAYVITFIPKSWNTAPDKVKQGWP根据本专利技术的具体实施方式的突变体Mut3(S23V-Y24N-R215A-K269D-H289Y)的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示。DSDDRVTPPAEPLDRMPDPYRPVNGRAETVVNNYIRKWQQVYSHRDGRKQQMTEEQREWLSYGCVGVTWVNSGQYPTNRLAFASFDEDRFKNELKNGRPRSGETRAEFEGRVAKESFDEEKGFQRAREVASVMNRALENAHDESAYLDNLKKELANGNDALRNEDARSPFYSALRNTPSFKERNGGNHDPSRMKAVIYSKHFWSGQDRSSSADKAKYGDPDAFRPAPGTGLVDMSRDRNIPRSPTSPGEGFVNFDYGWFGAQTEADADDTVWTHGNHYHAPNGSLGAMYVYESKFRNWSEGYSDFDRGAYVITFIPKSWNTAPDKVKQGWP本专利技术还提供了编码上述谷氨酰胺转胺酶突变体的基因。本专利技术还提供了包含上述编码上述谷氨酰胺转胺酶突变体的基因的重组载体。本专利技术还提供了包含上述编码上述谷氨酰胺转胺酶突变体的基因的重组细胞。根据本专利技术的制备所述谷氨酰胺转胺酶突变体的方法，包括以下步骤：构建包含编码上述谷氨酰胺转胺酶突变体的基因的重组载体；将所述重组载体导入宿主细胞中，诱导表达，获得高催化效率谷氨酰胺转胺酶。根据本专利技术的具体实施方式，对成熟的谷氨酰胺转胺酶MTG-WT的S2、S23、Y24、K269、R215、H289、K294等位点突变，组合成含五个氨基酸突变位点的突变体三个，将突变体重组载体转化毕赤酵母pPIC9k-pro/GS115，小摇管诱导表达，结果显示三个突变体的小管上清的活性都比野生酶高。对酶活高的克隆进行1L摇瓶表达，诱导72h，每24本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.热稳定性和酶活提高的谷氨酰胺转胺酶突变体，所述突变体通过对氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的野生型谷氨酰胺转胺酶进行以下定点突变而得：/nS2P-S23V-Y24N-R215A-K294L；/nS2P-S23V-Y24N-R215A-H289Y；或/nS23V-Y24N-R215A-K269D-H289Y。/n

【技术特征摘要】
1.热稳定性和酶活提高的谷氨酰胺转胺酶突变体，所述突变体通过对氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的野生型谷氨酰胺转胺酶进行以下定点突变而得：
S2P-S23V-Y24N-R215A-K294L；
S2P-S23V-Y24N-R215A-H289Y；或
S23V-Y24N-R215A-K269D-H289Y。


2.一种谷氨酰胺转胺酶基因，其特征在于，编码权利要求1所述的热稳定性和酶活提高的谷氨酰胺转胺酶突变体。


3.包含权利要求2所述谷氨酰...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋小平，王雅洁，王蔷，蔡晶晶，
申请(专利权)人：安徽医学高等专科学校，
类型：发明
国别省市：安徽;34