一种Macrosialin基因缺失动脉粥样硬化小鼠模型的构建方法及其应用技术

本发明专利技术属于动物模型构建技术领域，尤其涉及一种Macrosialin基因缺失动脉粥样硬化小鼠模型的构建方法及其应用。所述构建方法包括：将ApoE

【技术实现步骤摘要】
一种Macrosialin基因缺失动脉粥样硬化小鼠模型的构建方法及其应用


[0001]本专利技术涉及动物模型构建
，特别涉及一种Macrosialin基因缺失动脉粥样硬化小鼠模型的构建方法及其应用。

技术介绍

[0002]动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是由遗传、环境等多因素导致的局灶性慢性炎症血管疾病，以脂质沉积、内膜增厚为特征，形成粥样斑块病灶或纤维脂质斑块，是造成心血管疾病、中风和外周动脉疾病的主要原因。动脉粥样硬化的特征是粥样斑块的形成，粥样斑块形成的病理基础是泡沫细胞的形成。泡沫细胞大部分来源于聚集于动脉内膜下的巨噬细胞，小部分由平滑肌细胞和内皮细胞转化而来。血液循环中的单核细胞迁移到动脉内膜下层并分化为巨噬细胞。血管内膜下层的氧化型低密度脂蛋白(ox
‑
LDL)被巨噬细胞表面的清道夫受体识别并大量吞噬，导致脂质在巨噬细胞中积累，巨噬细胞转化为富含脂质的泡沫细胞。泡沫细胞及ox
‑
LDL对动脉粥样斑块的作用主要体现在以下两个方面：一方面，泡沫细胞产生活性氧(reactive oxygen species，ROS)并诱导一系列炎症反应，招募更多的巨噬细胞进入血管内膜下层转化为泡沫细胞，导致血管壁出现脂肪条纹，加速动脉粥样硬化的进程；另一方面，ox
‑
LDL进一步诱导泡沫细胞坏死，形成的坏死核心是晚期斑块不稳定的典型特征。斑块破裂会跟随血液流动堵塞心脑血管，这是造成脑梗和心梗的直接原因。因此，减轻巨噬细胞吞噬脂质，减缓炎症反应以及防止斑块破裂对防治动脉粥样硬化性心血管疾病具有重要意义。
[0003]巨噬细胞黏蛋白(Macrosialin)作为一种清道夫受体能够结合修饰的LDL、磷脂酰丝氨酸和凋亡细胞。Macrosialin基因在单核巨噬细胞表面特异性高且丰度高的特点，使得巨噬细胞黏蛋白具有结合和内化ox
‑
LDL的可能性。目前，巨噬细胞黏蛋白在泡沫细胞形成和动脉粥样硬化发展中的作用尚不清楚。
[0004]实验动物模型在科学实验和药物研发中占有重要地位，小鼠和基因工程小鼠资源是目前疾病机制研究、基因功能研究、药物创制等领域最重要的动物模型之一，也是这些领域创新研究的必须条件。利用基因工程小鼠针对动脉粥样硬化病理过程中的各个分子环节进行研究，对阐明动脉粥样硬化发生发展过程中的分子机制，寻找动脉粥样硬化治疗的分子靶点和相关疾病的治疗具有重要的意义。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种Macrosialin基因缺失动脉粥样硬化小鼠模型的构建方法，通过成功在小鼠体内敲除Macrosialin基因以探索该基因的表达与动脉粥样硬化疾病发生、发展的相互关系，以此为研究Macrosialin在动脉粥样硬化疾病发生、发展中的作用及动脉粥样硬化药物筛选等方面提供经济、便捷、可靠的动物模型，并进一步提供了以Macrosialin基因作为药物靶标在筛选治疗动脉粥样硬化疾病的药物中的
应用以及Macrosialin抑制剂在制备治疗动脉粥样硬化疾病药物中的应用。
[0006]本专利技术第一方面提供了一种Macrosialin基因缺失动脉粥样硬化小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：
[0007]S1、将ApoE
‑
/
‑
基因型小鼠的Macrosialin基因敲除，获得ApoE
‑
/+
Macrosialin
‑
/+
基因型的F0代小鼠；
[0008]S2、将所述F0代小鼠与所述ApoE
‑
/
‑
基因型小鼠回交，筛选获得ApoE
‑
/
‑
Macrosialin
‑
/+
基因型的F1代小鼠；
[0009]S3、将所述F1代小鼠自交，筛选获得ApoE
‑
/
‑
Macrosialin
‑
/
‑
基因型的F2代小鼠，经高脂饮食诱导，获得动脉粥样硬化(AS)小鼠模型；
[0010]其中，步骤S1中，所述F0代小鼠的获得具体包括如下步骤：
[0011]S11、将所述Macrosialin基因的2号外显子区设计为敲除区域，分别设计并合成靶向2号外显子区上、中和下游的3个sgRNA；
[0012]S12、将Cas9 mRNA和3个所述sgRNA注入受精卵细胞中，筛选存活的所述受精卵并移植至假孕雌鼠体内孕育，从出生小鼠中筛选得到ApoE
‑
/+
Macrosialin
‑
/+
基因型的所述F0代小鼠；其中，所述受精卵由ApoE
‑
/
‑
基因型小鼠精子和C57BL/6小鼠卵细胞体外受精形成。
[0013]进一步地，步骤S11中，3个所述sgRNA分别靶向2号外显子的95
‑
117bp、157
‑
179bp和271
‑
293bp。
[0014]进一步地，步骤S11中，3个所述sgRNA靶向的DNA序列分别如SEQ ID NO.1
‑
3所示。
[0015]进一步地，步骤S11中，所述sgRNA通过体外转录技术合成得到，包括以下步骤：设计用于扩增所述sgRNA的引物IVT
‑
1、IVT
‑
2、IVT
‑
3和IVT
‑
4，以pX330质粒为模板，将引物IVT
‑
1、IVT
‑
2和IVT
‑
3分别与引物IVT
‑
4配对，通过PCR反应分别扩增获得对应的DNA产物，以所述DNA产物分别作为模板，经体外转录并纯化获得所述sgRNA；其中，用于扩增所述sgRNA的引物的DNA序列如SEQ ID NO.4
‑
7所示。
[0016]进一步地，步骤S12中，所述Cas9 mRNA通过体外转录技术合成得到，包括以下步骤：以线性化pST1374
‑
Cas9质粒为模板，经体外转录并纯化获得所述Cas9 mRNA。
[0017]进一步地，步骤S12中，每个所述sgRNA和所述Cas9 mRNA以等比例注射进受精卵细胞中。
[0018]另外，本专利技术第二方面提供了如上所述的Macrosialin基因缺失动脉粥样硬化小鼠模型的构建方法构建得到的动脉粥样硬化小鼠模型在研究Macrosialin基因与动脉粥样硬化疾病相关作用和机制中应用以及在研究动脉粥样硬化发生、发展与动脉粥样硬化药物筛选中的应用。
[0019]另外，本专利技术第三方面提供了Macrosialin基因作为药物靶标在筛选治疗动脉粥样硬化疾病的药物中的应用。
[0020]另外，本专利技术第四方面提供了Macrosiali本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Macrosialin基因缺失动脉粥样硬化小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将ApoE
‑
/
‑
基因型小鼠的Macrosialin基因敲除，获得ApoE
‑
/+
Macrosialin
‑
/+
基因型的F0代小鼠；S2、将所述F0代小鼠与所述ApoE
‑
/
‑
基因型小鼠回交，筛选获得ApoE
‑
/
‑
Macrosialin
‑
/+
基因型的F1代小鼠；S3、将所述F1代小鼠自交，筛选获得ApoE
‑
/
‑
Macrosialin
‑
/
‑
基因型的F2代小鼠，通过高脂饮食诱导，获得动脉粥样硬化(AS)小鼠模型；其中，步骤S1中，所述F0代小鼠的获得具体包括如下步骤：S11、将所述Macrosialin基因的2号外显子区设计为敲除区域，分别设计并合成靶向2号外显子区上、中和下游的3个sgRNA；S12、将Cas9 mRNA和3个所述sgRNA注入受精卵细胞中，筛选存活的所述受精卵并移植至假孕雌鼠体内孕育，从出生小鼠中筛选得到ApoE
‑
/+
Macrosialin
‑
/+
基因型的所述F0代小鼠；其中，所述受精卵由ApoE
‑
/
‑
基因型小鼠精子和C57BL/6小鼠卵细胞体外受精形成。2.根据权利要求1所述的Macrosialin基因缺失动脉粥样硬化小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤S11中，3个所述sgRNA分别靶向所述Macrosialin基因的2号外显子的95
‑
117bp、157
‑
179bp和271
‑
293bp。3.根据权利要求2所述的Macrosialin基因缺失动脉粥样硬化小鼠模...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑前前，贾婧，段良伟，晁天柱，梁银明，卢燎勋，赵雨苁，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：