一种利用布拉迪酵母表达四环素降解酶Tet(X)的方法与应用技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体公开了一种利用布拉迪酵母表达四环素降解酶Tet(X)的方法与应用。通过LoxP/Cre重组酶系统构建尿嘧啶营养缺陷型酵母菌株S.boulardi/URA3

【技术实现步骤摘要】
一种利用布拉迪酵母表达四环素降解酶Tet(X)的方法与应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种利用布拉迪酵母表达四环素降解酶Tet(X)的方法与应用。

技术介绍

[0002]自1928年AlexanderFleming发现了第一个抗生素青霉素，抗生素成为人和动物不可替代的医疗产品。一项调查预测，全球抗菌素消费量将增加67.0％，从63151
±
1560吨(2010年)增至105596
±
3605吨(2030年)。四环素类抗生素是最常见的抗生素之一，以其广谱抗菌活性著称，对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌、螺旋体、支原体和寄生虫均有效。广谱、低成本、生产和使用方便促成四环素类抗生素被广泛应用于人医预防用药和临床治疗、兽药以及动物生长促进剂等，且这些四环素大多以口服给药途径进入人和动物机体。每年都大量的四环素类抗生素被生产和使用，特别是畜禽养殖。畜禽养殖的四环素消费量在所有被调查的洲中最高，分别为欧洲占比41.2％、美洲占比40.8％、非洲占比31.7％和亚洲占比31.2％。2013年我国四环素类抗生素消费量约6950吨，兽药抗生素占74.6％(猪47.5％，鸡16.2％，其他动物10.9％)。
[0003]然而，随着四环素类抗生素的广泛使用，一些棘手的问题也逐渐体现出来。由于人体和动物对四环素类抗生素的生物利用度低，有相当比例(70.0％～90.0％)的四环素类抗生素随粪便、尿液等排泄物流入到周围环境中。四环素类抗生素在粪便、土壤、污水、污泥、地表水、废水，甚至饮用水中被频繁检测到。环境中残留的抗生素一方面通过食物链进入人体，另一方面促使环境中的细菌加速抗生素耐药基因的形成，耐药基因的富集和扩散威胁着临床治疗的效果。
[0004]2019年，我国学者发现一种新的四环素类抗生素耐药基因tet(X)亚型—tet(X4)，tet(X4)对人医和兽医临床治疗构成威胁，但也为四环素类抗生素的降解提供了新的途径。然而，据我们所知，细菌作为表达tet(X4)的宿主菌具有生物安全风险。酵母作为一种表达重组蛋白的工具，近年来受到越来越多的关注。专利CN111172180A
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公开了一种四环素类抗生素降解基因tet(X)的优化及其在真核表达系统中的应用。其在筛选阳性转化子的过程中一般使用抗生素作为选择压力，可以避免由于分离或结构不稳定性而引起的质粒丢失。但使用抗生素抗性作为选择标记需要在整个培养器件供应抗生素，成本较高。

技术实现思路

[0005]针对目前现有技术存在的不足，本专利技术的第一个目的在于提供一种能够表达四环素降解酶Tet(X)的工程酵母S.boulardii。
[0006]本专利技术的第二个目的是提供一种能够表达四环素类抗生素降解酶Tet(X)的工程酵母S.boulardii的构建方法。
[0007]本专利技术的第三个目的是提供上述工程酵母S.boulardi在降解四环素类抗生素残留中的应用。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下：
[0009]一种表达四环素降解酶Tet(X)的工程酵母S.boulardii的构建方法，具体包括如下步骤：
[0010]S1、构建尿嘧啶(Uracil)营养缺陷型酵母菌株S.boulardi/URA3
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；
[0011]S2、构建pURA
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αf
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opt(X4)质粒：将携带经序列优化后tet(X4)基因的质粒pCEV
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αf
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opt(X4)的Zeocin筛选标记ble改造为Uracil筛选标记URA3，同时构建表达载体中的α因子信号肽；
[0012]S3、将步骤S2构建的质粒转入步骤S1所述尿嘧啶(Uracil)营养缺陷型酵母菌株S.boulardi/URA3
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/
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制备好的感受态中，转化液涂布至培养基筛选获得工程酵母。
[0013]S.boulardii属于真菌，由于生殖隔离的存在，S.boulardii很难将tet(X4)传播给其它临床致病性细菌。因此以S.boulardii作为表达tet(X4)的宿主菌，一方面可以在发挥其自身原有的益生功能同时实现对四环素类抗生素残留的源头(肠道)消除，最大限度地避免四环素类抗生素流入到周围环境；另一方面可避开以往基因工程菌的缺陷，杜绝了临床重要耐药基因tet(X4)的外泄风险。
[0014]在本专利技术的前期实验结果显示，以抗生素作为筛选标记，即使往培养基中添加抗生素，在培养后期依然会出现质粒大量丢失现象，这严重影响了阳性转化子的筛选效率。因此，我们选用尿嘧啶(Uracil)作为筛选标记，敲除原菌URA3基因，构建含URA3基因的质粒转入菌株，这样只要出现丢失质粒的菌都因无法合成尿嘧啶而死亡，存活的菌株均为含有质粒的菌株，提高了活菌中的质粒携带率，可提高表达水平。
[0015]本专利技术将携带经序列优化后的tet(X4)基因的质粒pCEV
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αf
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Opt(X4)的Zeocin筛选标记(ble)改造成Uracil筛选标记(URA3)，以保证Opt(X4)在S.boulardi中不会丢失，同时构建表达载体中的α因子信号肽实现外源蛋白的胞外分泌表达。
[0016]优选地，为了稳定地表达降解酶，步骤S1所述尿嘧啶(Uracil)营养缺陷型S.boulardi菌株的构建方法具体为：通过构建选自G418抗性Kan和Zeocin抗性ble不同抗性基因的同源臂，将其逐一插入替换到S.boulardi染色体上URA3的等位基因上，再利用LoxP/Cre重组酶系统，去除抗性基因得到。
[0017]优选地，步骤S2所述构建pURA
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αf
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opt(X4)质粒的具体方法为：以质粒pCEV
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αf
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opt(X4)为模板通过PCR扩增除Loxp
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ble
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Loxp外的质粒骨架部分，以质粒pPL5071_TEF1
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Cre_URA3为模板通过PCR扩增URA3基因及其启动子，两种PCR产物混合后加入DpnI内切酶，酶切产物加入到DH5α感受态，纯化阳性DH5α转化子。
[0018]本专利技术为了最大程度提高四环素降解酶Tet(X)的表达量，使用了优化过后的密码子序列进行表达，优化后tet(X4)基因的核苷酸优化序列可参考专利CN111172180A。
[0019]本专利技术还提供了上述工程酵母S.boulardi在降解四环素类抗生素中的应用。
[0020]在上述应用进行降解四环素类抗生素时，将所述工程酵母S.boulardi菌株发酵培养，收集发酵上清后进行浓缩，在NADPH、Mg
2+
、O2的共同参与下表现出生物降解功能。
[0021]与现有技术相比，本专利技术的有益本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达四环素降解酶Tet(X)的工程酵母S.boulardii的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、构建尿嘧啶营养缺陷型酵母菌株S.boulardi/URA3
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；S2、构建pURA
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αf
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opt(X4)质粒：将携带经序列优化后tet(X4)基因的质粒pCEV
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αf
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opt(X4)的Zeocin筛选标记ble改造为Uracil筛选标记URA3，同时构建表达载体中的α因子信号肽；S3、将步骤S2构建的质粒转入步骤S1所述尿嘧啶营养缺陷型酵母菌株S.boulardi/URA3
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制备好的感受态中，转化液涂布至培养基筛选获得所述工程酵母。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤S1所述尿嘧啶营养缺陷型S.boulardi菌株的构建具体方法为：通过构建G418抗性Kan和Zeocin抗性ble基因的同源臂，将其逐一插入替换到S.boulardi染色体上URA3的等位基因上，再利用LoxP/Cre重组酶系统，去除抗性...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙坚，贺骞，林卓宇，张晓净，廖晓萍，刘雅红，
申请(专利权)人：岭南现代农业科学与技术广东省实验室，
类型：发明
国别省市：