一种制备高表达纳米抗体毕赤酵母工程菌及快速筛选的方法技术

本发明专利技术公开了一种被高表达纳米抗体毕赤酵母工程菌的方法，其包括如下步骤：纳米表达质粒的构建、扩增、线性化和回收、培养单克隆、转化进入受体细胞。本发明专利技术提供了一种不利用抗生素浓度并且能够快速筛选纳米抗体高表达的毕赤酵母工程菌。毕赤酵母工程菌。毕赤酵母工程菌。

【技术实现步骤摘要】
一种制备高表达纳米抗体毕赤酵母工程菌及快速筛选的方法


[0001]本专利技术属于生物工程和医药工程
，具体涉及到一种制备高表达纳米抗体毕赤酵母工程菌及快速筛选的方法。

技术介绍

[0002]纳米抗体最早由比利时科学家于1993年在《Nature》杂志中首次报道，是骆驼科动物(骆驼、大羊驼、羊驼及其近亲物种)缺失轻链的天然重链抗体的可变区组成的单域抗体，该抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区，VHH晶体为2.5nm，长4nm，分子量只有15kDa，因此被称作纳米抗体。纳米抗体(Nanobody,Nbs)是抗体家族的新成员，具有相对分子质量小、人源化简单、亲和力高、稳定性高、可微生物表达、免疫原性低、穿透力强、可溶性好等优势，在医学基础研究以及疾病诊断和治疗方面备受关注。
[0003]纳米抗体诸多方面均优于传统抗体。基于羊驼重链抗体的VHH单域抗体的特殊结构，兼具了传统抗体与小分子药物的优势，几乎完美克服了传统抗体的开发周期长，稳定性较低，保存条件苛刻等缺陷，逐渐成为新一代治疗性生物医药与临床诊断试剂中的新兴本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备高表达纳米抗体毕赤酵母工程菌的方法，其特征在于：包括如下步骤：纳米表达质粒的构建、扩增、线性化和回收：将纳米抗体基因进行优化，得到优化后纳米抗体基因；提取原始质粒，扩增质粒后，，对于扩增后的质粒进行酶切制得线性化纳米表达质粒；培养单克隆：以1μL的受体菌在含有培养基的平板上划线。倒置于恒温培养箱中，恒温培养至长出分散的单克隆菌落；挑取单克隆菌落接入5mL的培养基，恒温250rpm培养。培养物接入新鲜培养基中，恒温250rpm培养至OD600＝1.3
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1.5；收集培养物，离心去上清预冷无菌水重悬细胞；离心去上清，预冷无菌水重悬细胞；离心去上清预冷LiAc制备液重悬细胞，静置处理；离心去上清，预冷山梨醇溶液重悬细胞；离心去上清，预冷山梨醇溶液重悬细胞；离心去上清，预冷山梨醇溶液重悬细胞；离心去上清，预冷山梨醇溶液重悬细胞；分装感受态细胞待用于后续实验；转化进入受体细胞：受体菌感受态细胞中加入预冷的线性化重组质粒混匀，冰浴；将混合液转移至预冷的电转杯内，电转杯置入电转仪(Bio
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Rad)；电转仪参数设置为Pichia预设，电击1次后立即冰浴冷却30秒，电击≥5次；加入山梨醇溶液，轻轻吹打均匀，将内容物转移至无菌离心管中；离心5分钟，去部分上清，剩200μL菌液重悬细胞，恒温培养；得到的细胞悬液涂布在含有选择性抗生素的培养基的平板上，剩余悬液涂布无抗平板；室温静止至平板上无显著流动液体，转移至恒温培养箱，倒置培养至选择性抗生素平板长出明显的单克隆菌落；简单快速挑选阳性拷贝菌株的方法；挑取转化后在低浓度选择性抗生素抗性平板长出明显的单克隆菌落，对单克隆进行编号，同时将...

【专利技术属性】
技术研发人员：左涛，刘立，公少华，王鹏源，汪芸，王满朝，
申请(专利权)人：江苏耀海生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：