本发明专利技术公开了一种双孢蘑菇酪氨酸酶表达载体，该表达载体是将SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示的双孢蘑菇酪氨酸酶突变编码序列克隆至毕赤酵母胞内表达载体而获得的。本发明专利技术利用定位突变提升了重组酪氨酸酶的稳定性，得到的双孢蘑菇酪氨酸酶编码基因构建的表达载体具有更优异的酶活稳定性，酪氨酸催化能力大幅提升，拓展了此细胞裂解液的应用范围。拓展了此细胞裂解液的应用范围。拓展了此细胞裂解液的应用范围。
【技术实现步骤摘要】
胞内表达双孢蘑菇酪氨酸酶的毕赤酵母工程菌株及其应用
[0001]本专利技术涉及一种工程菌株，具体地说是一种胞内表达双孢蘑菇酪氨酸酶的表达载体及转染得到的毕赤酵母工程菌株及其在黑色素催化剂中的应用，属于生物工程
技术介绍
[0002]随着生活节奏加快，各种压力、不健康生活作息等因素，白发现象越来越年轻化。同时，随着绿色健康消费观念的提升，白发人群愿意选择更温和健康的黑发产品。目前，市场上的白发转黑产品主要有化学型和植物型。化学型主要含有如苯二胺类等，长期使用有引起强过敏和致癌的风险，为了规避化学此风险，本领域技术人员提出温和风险低的植物型黑发产品，多以天然植物黑色素为原料制备得到，由于植物型产品的天然特性使其黑发效果及头发附着性均较化学型产品逊色，因此也限制了植物型产品的使用。
[0003]本领域技术人员一直尝试模拟头发黑色素形成的自然过程，通过生物氧化催化剂，如酪氨酸酶，诱导黑色素的基本成分氨基酸，如酪氨酸，按照天然黑色素的形成进行生物合成生成天然黑色素。酪氨酸酶是合成天然黑色素的关键酶，能有效催化黑色素形成反应中的前两步反应，第一步酪氨酸羟基化形成多巴，多巴再被氧化成多巴醌，进一步生成半胱氨酸酰基色素，最终聚合成黑色素。
[0004]目前表达双孢蘑菇酪氨酸酶一般使用大肠杆菌表达体系，其技术缺陷是缺乏翻译后修饰系统，易形成包涵体，表达出的酪氨酸酶活力低，产量低，生产成本较高，发酵液含有内毒素等不能直接用于黑发产品的应用，如需用于此类应用还需进一步提纯处理，增加成本的同时会降低酪氨酸酶的活性及得率。现有技术还有选择酿酒酵母体系表达双孢蘑菇酪氨酸酶，酿酒酵母表达体系存在过糖基化现象，而且会在菌株发酵过程中产生乙醇，如需用于黑发产品中需要单独去除乙醇，操作复杂，成本也相应提高，最主要的是在乙醇去除过程中也容易降低酪氨酸酶活性。巴斯德毕赤酵母系统具有翻译后修饰(包括糖基化)，可以表达具有正常蛋白结构和功能双孢蘑姑酪氨酸酶的功效，但是毕赤酵母表达体系具有缺陷，即表达的双孢蘑菇酪氨酸酶的酶活稳定性欠佳，菌株发酵液裂解液催化酪氨酸产生5，6
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二羟基吲哚(DHI)的能力也欠佳，无法满足商品化需求。另外，毕赤酵母发酵过程中以甲醇作为唯一碳源，期间需不断补充甲醇，如采用胞外表达酪氨酸酶可能会影响重组蛋白的稳定性。目前酵母胞内重组表达酪氨酸酶尚未见报导。第三，细胞裂解混合液中，还含有来自酵母自身的蛋白酶，现有技术对重组蛋白稳定性提升主要是利用稳定剂，或者添加蛋白酶抑制剂等。上述稳定剂虽然可以提升酵母发酵提取物中重组酪氨酸酶的稳定性，但是会增加制备成本，另外上述成分对其他功效成分的效能可能会产生影响。
技术实现思路
[0005]本专利技术所要解决的首要技术问题是提出一种双孢蘑菇酪氨酸酶表达载体。
[0006]本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供一种利用上述双孢蘑菇酪氨酸酶表达
载体构建的胞内表达双孢蘑菇酪氨酸酶的毕赤酵母工程菌株。
[0007]本专利技术所要解决的又一技术问题在于提供上述双孢蘑菇酪氨酸酶表达载体及工程菌株的新用途。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术采用以下的技术方案：
[0009]一种双孢蘑菇酪氨酸酶表达载体，所述表达载体是将SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示的双孢蘑菇酪氨酸酶突变编码序列克隆至毕赤酵母胞内表达载体而获得。
[0010]其中较优地，所述双孢蘑菇酪氨酸酶突变编码序列编码SEQ ID No.2或SEQ ID No.4所示氨基酸序列的蛋白质。
[0011]其中较优地，所述表达载体结构为图1所示的pP I CZa::AbTryA。
[0012]上述双孢蘑菇酪氨酸酶表达载体在制备黑色素催化剂中的应用。
[0013]一种胞内表达双孢蘑菇酪氨酸酶工程菌株，所述工程菌株是通过将上述双孢蘑菇酪氨酸酶表达载体线性化后转化导入毕赤酵母细胞而获得的。
[0014]上述胞内表达双孢蘑菇酪氨酸酶工程菌株在制备黑色素催化剂中的应用。
[0015]一种富铜胞内表达双孢蘑菇酪氨酸酶工程菌株，由下述方法培养得到：
[0016](1)将上述胞内表达双孢蘑菇酪氨酸酶工程菌株接种于铜浓度为100μg/ml及以下的培养基中培养；
[0017](2)将步骤(1)的发酵物接种到不含铜的培养基中至稳定生长；
[0018](3)逐步在步骤(2)的培养基中增加铜浓度至500μg/ml，反复培养50代以上，即得。
[0019]上述富铜胞内表达双孢蘑菇酪氨酸酶工程菌株在制备黑色素催化剂中的应用。
[0020]一种胞内表达双孢蘑菇酪氨酸酶的毕赤酵母全细胞催化剂，所述催化剂由下述方法构建得到：将上所述的工程菌株发酵培养后收集菌体，然后进行破碎获得细胞裂解液。在化妆品的生产中为了提高商品性能，还可以根据需要增加过滤程序，将细胞碎片过滤掉，取上清液进行后续制备。
[0021]一种发用制剂，含有下述(a)和(b)，
[0022](a)酪氨酸、酪氨酸衍生物、多巴或多巴衍生物；
[0023](b)上述的胞内表达双孢蘑菇酪氨酸酶的毕赤酵母全细胞催化剂。
[0024]与现有技术相比较，本专利技术具有以下的技术效果：
[0025](1)本专利技术解决了现有技术中表达双孢蘑菇酪氨酸酶需要添加蛋白酶抑制剂或稳定剂造成的问题。本专利技术利用定位突变提升了重组酪氨酸酶的稳定性，得到的双孢蘑菇酪氨酸酶编码基因构建的表达载体具有更优异的酶活稳定性，酪氨酸催化能力大幅提升，拓展了此细胞裂解液的应用范围。
[0026](2)本专利技术采取胞内表达酪氨酸酶的策略，重组双孢蘑菇酪氨酸酶不直接释放到胞外，可以有效的避免在表达过程中甲醇对蛋白稳定性的影响，避免发酵过程中长时间的高速搅拌和气液界面等物理条件等破环表达蛋白高级结构而导致聚合体形成；避免酵母细胞膜上KEX
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2样蛋白水解酶对分泌型重组表达蛋白的水解，从而提高重组双孢蘑菇酪氨酸酶的稳定性，保证使用效果。
[0027](3)本专利技术提供的工程菌株发酵液经裂解破碎后发酵液中的酪氨酸酶活力高，无需进行蛋白提纯及乙醇去除等处理工艺，发酵液可直接作为催化剂催化形成天然黑色素前体，有效附着在头发上，进一步氧化成自然黑色素，本专利技术提供的催化剂可以带来更好的染
色效果及更强的附着力。
[0028](4)本专利技术提供的富铜毕赤酵母发酵液中的铜元素通过酵母在生长过程中对铜元素的吸收和转化，使铜与毕赤酵母表达的酪氨酸酶结合，从而显著增强了酪氨酸酶的催化活力，加强黑色素催化效果。
[0029](5)本专利技术提供的富铜毕赤酵母全细胞催化剂生产成本低，效率高，温和安全。本专利技术提供的发酵系统中使用的巴斯德毕赤酵母，以甲醇作为唯一碳源，不需要使用葡萄糖等作为碳源，而且可以进行高密度发酵来提高产率，其推广应用对于环境保护和碳中和，有重要的贡献。
附图说明
[0030]图1为pP I CZa::AbTryA质粒图谱；
[00本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种双孢蘑菇酪氨酸酶表达载体，其特征在于：所述表达载体是将SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示的双孢蘑菇酪氨酸酶突变编码序列克隆至毕赤酵母胞内表达载体而获得。2.如权利要求1所述的双孢蘑菇酪氨酸酶表达载体，其特征在于：所述双孢蘑菇酪氨酸酶突变编码序列编码SEQ ID No.2或SEQ ID No.4所示氨基酸序列的蛋白质。3.如权利要求1所述的双孢蘑菇酪氨酸酶表达载体，其特征在于：所述表达载体结构为图1所示的pPICZa::AbTryA。4.权利要求1至3中任意一项所述的双孢蘑菇酪氨酸酶表达载体在制备黑色素催化剂中的应用。5.一种胞内表达双孢蘑菇酪氨酸酶工程菌株，其特征在于通过将权利要求1至3中任意一项所述的表达载体线性化后转化导入毕赤酵母细胞而获得。6.如权利要求5所述的胞内表达双孢蘑菇酪氨酸酶工程菌株在制备黑色素催化剂中的应用。7...
【专利技术属性】
技术研发人员：王娟，刘廷竹，李宇涵，
申请(专利权)人：知想南京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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