一种抗除草剂的基因及其应用制造技术

本发明专利技术属于植物基因工程技术领域，本发明专利技术公开了一种抗除草剂的基因及其应用。具体的说，本发明专利技术涉及抗除草剂的基因及其编码的蛋白质、构建的载体以及它们的应用。该基因可以用来在农作物中表达而使农作物对除草剂的抗性增强。本发明专利技术可以运用在抗除草剂转基因作物研制的领域，有很好的应用前景。有很好的应用前景。有很好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种抗除草剂的基因及其应用


[0001]本专利技术属于植物基因工程
，具体的说，本专利技术涉及抗除草剂的基因及其编码的蛋白质、构建的载体以及它们的应用。

技术介绍

[0002]随着植物直播栽培技术在农业生产中的大面积应用，植物直播生产中农田杂草问题成为影响农作物产量的重要因素。特别是稻田禾本科杂草生理、代谢过程与水稻高度相似，缺乏适当的除草剂加以防控。由于传统育种驯化进程不涉及除草剂耐受性状，自然遗传资源中的抗性资源极为罕见。利用除草剂抑制靶标基因，筛选鉴定内源抗性突变体是目前开发主粮作物抗除草剂种质资源的可行途径。例如，通过EMS诱变咪唑类除草剂靶基因ALS，可获得抗性资源。近年来，该突变广泛应用于“金粳818”等品种中，在化学除草方面表现出显著的栽培优势。但是已知主要除草剂靶基因如EPSPS、ACCase、ALS、HPPD等的内源抗性位点多为国外商业公司专利保护。同时，随着单一类型除草剂的反复施用，田间杂草获得性抗性快速增加。因此，发掘植物新型除草剂抗性基因并通过转基因手段表达异源代谢基因获得抗除草剂性状，对培育抗除草剂植物十分必要。
[0003]芳氧苯氧丙酸酯(Aryloxyphenoxy propinoate，AOPP)类除草剂是德国赫斯特公司在20世纪70年代开发出来的一类高活性除草剂。具有高效、广谱、低毒、低残留等优点，已被广泛应用于农业生产中。目前，商品化的AOPP类除草剂约有20余种。截至2014年，全球AOPP类除草剂的销售额超过121.7亿美元，是继草甘膦后世界上使用最广泛的除草剂类别之一。AOPP类除草剂一般属于内吸型选择型除草剂，主要用于阔叶作物田(如油菜、花生、大豆、番茄等)以防除一年生和多年生的禾本科杂草，施药后2周杂草即可被杀死。然而该类某些除草剂(如精喹禾灵，高效氟吡甲禾灵等)对禾本科作物同样具有灭生性，并且其在生态环境中的残留会危害到后茬作物及非靶标生物。这一定程度上限制了这些除草剂的使用范围和使用时间。因此，培育具有该类除草剂抗性的禾本科农作物具有重要意义，不仅可扩展该类除草剂的使用范围而且可减少农业生产费用。
[0004]AOPP类除草剂的作用机理主要是通过抑制乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)活性使植物死亡。该酶催化ATP依赖乙酰辅酶A羧化作用诱导脂肪酸与类黄酮生物合成中的一种关键代谢产物——丙二酸单酰辅酶A，这是植物中脂肪酸生物合成的首要关键步骤，然后在脂肪酸合成酶作用下形成脂肪酸。若丙二酸单酰辅酶A的合成停止，则对ACCase的抑制将使植物丧失这种中间产物，导致膜结构的破坏，透性增强，细胞破坏。部分禾本科作物(如小麦和水稻)的ACCase位点突变能降低AOPP类除草剂对其的敏感性，植物表达这些突变蛋白可以抗AOPP类除草剂。小麦和水稻相关位点突变的ACCase在植物中表达而获得抗性已被专利保护(中国专利：112410308A，109355264B)。但是为了提高转基因农作物的抗性水平和增加抗性基因的多样性，生产应用中仍然需要新的抗除草剂基因和以此为基础的转基因抗除草剂植物。
[0005]谷胱甘肽
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转移酶(GSTs)能催化三肽谷胱甘肽与若干亲电、亲脂化合物偶联，形
成水溶性产物。该酶存在于从哺乳动物到昆虫和植物的广泛物种中，并且在许多有毒物质(包括致癌物、农药和除草剂)的解毒中发挥着重要作用，这引起了农药研究者们的广泛关注。在植物中，GSTs主要分为phi,zeta,tau,theta,lambda和dhar六个类。虽然研究者从水稻、玉米、小麦和其他植物物种已经鉴定出具有抗除草剂能力的GST基因。但能催化精喹禾灵与谷胱甘肽偶联并导致抗性的GST的基因尚未被发现。
[0006]本专利技术首先发现了对除草剂代谢作用增强的棒头草品种，然后利用其转录组序列的信息克隆了一个GSTs基因GST1，并且进一步在水稻愈伤组织中证明了GST1基因的抗除草剂能力及其在发展转基因抗除草剂农作物中的用途。而本专利技术涉及一种谷胱甘肽
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转移酶基因GST1，其转基因至少能使水稻对精喹禾灵和高效氟吡甲禾灵等AOPP类除草剂中一种产生抗性。

技术实现思路

[0007]本专利技术的首要目的是提供一种抗除草剂基因。将该抗除草剂基因导入对精喹禾灵敏感的植物，可以使这些敏感植物对于除草剂的耐受性显著增加，从而原本不能用在这些植物上来控制杂草用的除草剂，可用于导入这种抗除草剂基因的植物。
[0008]为了解决上述技术问题，
[0009]本专利技术提供了一种抗除草剂基因，该基因的核苷酸序列为以下任意一种：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2，以及功能相同的同源性基因序列。
[0010]所述的除草剂为芳氧苯氧丙酸酯类，进一步包含精喹禾灵、高效氟吡甲禾灵、精噁唑禾草灵、禾草灵、炔草酯、恶唑酰草胺、氰氟草酯中的至少一种。
[0011]本专利技术第二个方面的目的是提供所述的抗除草剂基因编码的蛋白质多肽，氨基酸序列包括：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4。
[0012]本专利技术第三个方面的目的是提供一种表达抗除草剂基因的质粒，包含所述的核苷酸序列。
[0013]该质粒，包含核苷酸序列分子与控制表达的核苷酸序列连接而成的表达框，该核苷酸序列编码上述蛋白质多肽。
[0014]作为本专利技术的一种优选方式，谷胱甘肽
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转移酶基因GST1基因片段与双酶切好的pET
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28a(+)进行IN FUSION(Takara，公司)试剂盒连接获得含谷胱甘肽
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转移酶基因的pET
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28a(+)重组质粒。
[0015]本专利技术第四个方面的目的是提供一种表达抗除草剂基因的重组菌株，将所述的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)获得重组菌株E.coli BL21(DE3)。
[0016]作为本专利技术的一种优选方式，构建好的含谷胱甘肽
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转移酶基因的pET
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28a(+)重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)获得重组菌株E.coli BL21(DE3)。
[0017]本专利技术第五个方面的目的是提供所述的抗除草剂基因的应用，将所述的基因转入植物中，获得抗性植株。
[0018]进一步地，构建表达抗除草剂基因的质粒，转入植物愈伤组织中，获得抗除草剂植物愈伤组织，然后分化出抗性植株。
[0019]进一步地，所述植物，包括双子叶和单子叶植物。
[0020]更进一步地，所述植物包括禾本科作物。
[0021]更进一步地，所述植物为水稻、玉米、棉花、小麦、大豆、草坪草或牧草。
[0022]本专利技术第六个方面的目的是提供一种体外重组表达蛋白快速检测其对除草剂解毒代谢作用的体系，包括步骤如下：
[0023](1)将SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列重组在蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗除草剂基因，该基因的核苷酸序列为以下任意一种：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2，以及功能相同的同源性基因序列。2.根据权利要求1所述的抗除草剂基因，其特征在于，所述的除草剂为芳氧苯氧丙酸酯类，进一步包含精喹禾灵、高效氟吡甲禾灵、精噁唑禾草灵、禾草灵、炔草酯、恶唑酰草胺、氰氟草酯中的至少一种。3.权利要求1或2所述的抗除草剂基因编码的蛋白质多肽，氨基酸序列包括：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4。4.一种表达抗除草剂基因的质粒，其特征在于，包含权利要求1所述的核苷酸序列。5.一种表达抗除草剂基因的重组菌株，其特征在于，将权利要求4所述的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)获得重组菌株E.coli BL21(DE3)。6.权利要求1或2所述的抗除草剂基因的应用，其特征在于，将所述的基因转入植物中，获得抗性植株；优选转入植物愈伤组织中，获得抗除草剂植物愈伤组织，然后分化出抗性植株。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物，包括双子叶和单子叶植物，进一步...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘浪，陈文，柏连阳，李宗芳，柏丁溢，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：