基于西南桦叶片不定根发生的遗传转化方法技术

本发明专利技术涉及一种基于西南桦叶片不定根发生的遗传转化方法，包括如下步骤：以西南桦带柄叶片为转化受体，对所述转化受体进行预培养；所述转化受体经预培养之后再用含有根癌农杆菌的转化液侵染；对侵染后的叶片进行共培养；清洗共培养后的叶片；对清洗后的叶片进行不定根诱导培养；其中所述根癌农杆菌中包含携带增强绿色荧光蛋白基因的表达载体。采用本发明专利技术的方法，无需经历愈伤组织诱导与分化等过程即可直接实现生根，大大缩短了转化周期；采用高效的清洗方式，增加了除菌力度，提升了西南桦转基因效率，从而成功实现根癌农杆菌介导的基于西南桦叶片不定根发生的遗传转化，遗传转化率可达到10％以上，具有周期短、转化率高且操作简单等优点。操作简单等优点。操作简单等优点。

【技术实现步骤摘要】
基于西南桦叶片不定根发生的遗传转化方法


[0001]本专利技术涉及植物基因工程
，具体涉及一种基于西南桦叶片不定根发生的遗传转化方法及体系。

技术介绍

[0002]西南桦(Betula alnoides Buch.
‑
Ham.ex D.Don)为桦木科桦木属高大乔木，天然分布于我国云南、广西、贵州、西藏等地，广东、福建亦成功引种栽培。其生长速度快，且树干通直，木材材质优良，是培育大径材的优良树种。西南桦为典型的菌根营养型植物，通过其根部与菌根真菌建立共生关系，从而高效吸收限制性营养。
[0003]目前，研究人员在桦木科植物中开展了遗传转化相关研究。专利CN105861542B提供了一种基于合子胚再生不定芽的白桦转基因方法，由于桦木种子极细小，造成操作困难，且每粒种子的遗传背景不同。专利CN114836468A提供了一种高效的白桦根转基因方法，该技术需要经历传统的“外植体
‑
愈伤组织
‑
不定芽
‑
生根”的过程，培养步骤繁琐，生根周期较长，不利于研究根部基因功能。再如刘雪羽等(2021)报道了基于发根农杆菌介导的光皮桦毛状根(hairy root)的遗传转化体系，由于毛状根是由发根农杆菌Ti质粒诱导而成，其根部结构、生长特性、有效成分等与植物正常根部存在明显不同，因而影响根系性状相关基因的功能鉴定。研究表明，西南桦根部与菌根真菌间的共生效率参差不齐，严重影响了该树种的生长效率，因而实际生产中对于根部高效共生的良种的需求极为迫切。鉴于西南桦传统育种周期长，通过基因工程手段分离根部关键基因，并对其进行性状遗传改良，成为西南桦育种的重要途径。然而，西南桦尚无遗传转化体系，严重制约了西南桦分子育种进程。

技术实现思路

[0004]基于此，有必要针对西南桦遗传转化体系缺失的现状，提供一种基于西南桦叶片不定根发生的遗传转化方法，该方法实现了遗传转化技术在西南桦中的成功应用并获得较高的转化率。
[0005]本专利技术的一个方面，提供了一种基于西南桦叶片不定根发生的遗传转化方法，包括如下步骤：
[0006]以西南桦带柄叶片为转化受体，对所述转化受体进行预培养；所述转化受体经预培养之后再用含有根癌农杆菌的转化液进行侵染；对侵染后的叶片进行共培养；清洗共培养后的叶片；对清洗后的叶片进行不定根诱导培养。
[0007]在其中一个实施例中，所述根癌农杆菌中包含携带增强绿色荧光蛋白基因的表达载体。
[0008]在其中一个实施例中，所述根癌农杆菌的菌株为GV3101。
[0009]在其中一个实施例中，所述表达载体为pSAK277::eGFP。
[0010]在其中一个实施例中，所述预培养培养基为含0.1mg/L～0.3mg/L NAA、15g/L～25g/L蔗糖、5g/L～7g/L琼脂的WPM培养基。
[0011]在其中一个实施例中，所述转化液的OD
600
值为0.3～0.5。
[0012]在其中一个实施例中，侵染时间为10min～15min。
[0013]在其中一个实施例中，共培养条件包括：
[0014](1)采用避光培养；(2)共培养的培养基为MS培养基；(3)共培养时间为2d～4d；和，(4)共培养温度为23℃～25℃。
[0015]在其中一个实施例中，共培养后的清洗方法为：
[0016](1)使用无菌水冲洗1遍；(2)使用浓度为500mg/L～1000mg/L的头孢噻肟钠水溶液浸洗1遍，浸洗时间为1min；(3)使用浓度为400mg/L～600mg/L的头孢噻肟钠水溶液再浸洗1遍，浸洗时间为1min；(4)无菌水冲洗2遍。
[0017]在其中一个实施例中，不定根诱导培养的培养基为含4mg/L～6mg/L卡那霉素、190mg/L～210mg/L头孢噻肟钠、15g/L～25g/L蔗糖、5g/L～7g/L琼脂、0.05mg/L～0.15mg/L NAA、0.01mg/L～0.03mg/L 6
‑
BA的WPM培养基。
[0018]在其中一个实施例中，所述不定根诱导培养的条件包括：
[0019](1)温度为23℃～25℃；(2)光照强度为2000lx～2500lx，每天光照时长为14h～16h；和，(3)培养时间为15d～30d，培养基更换频率为每5d～8d更换一次。
[0020]在其中一个实施例中，制备所述转化液的步骤包括：
[0021]将储存于
‑
80℃的含有携带增强绿色荧光蛋白的表达载体的根癌农杆菌接种于含抗生素的YEP培养液中进行第一次培养，得培养物1；取所述培养物1，加入不包含抗生素的YEP培养液进行第二次培养，得培养物2；将所述培养物2离心富集后加入重悬液，制备所述转化液。
[0022]在其中一个实施例中，所述重悬液包含8mmol/L～12mmol/L MES、8mmol/L～12mmol/L MgCl2和90μmol/L～110μmol/L乙酰丁香酮。
[0023]在其中一个实施例中，不定根诱导培养后，还包括对不定根诱导培养后的所得产物进行鉴别的步骤；鉴别方法为荧光显微检测。
[0024]本专利技术的另一个方面，提供了一种基于西南桦叶片不定根发生的遗传转化体系，使用所述的遗传转化方法构建。
[0025]与传统的技术相比，本专利技术还包含如下有益效果：
[0026](1)本专利技术使用无性系化的西南桦带柄全叶作为转化受体，统一了转基因子代株系的遗传背景，提高材料使用率的同时也节省了取材时间。
[0027](2)本专利技术采用叶片不定根体系进行遗传转化，无需经过传统的外植体
‑
愈伤组织
‑
不定芽
‑
生根的过程，直接实现从外植体到生根，生根率可达100％，大大缩短了转化周期，对植物根系性状相关基因的鉴定具有明显的优势。
[0028](3)本专利技术在共培养后的清洗环节采用冲
‑
浸
‑
冲的方法，提升了除菌力度，降低了后期除菌难度，提高了西南桦转基因效率，遗传转化率可达到10％以上。
附图说明
[0029]为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前
提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0030]图1是实施例1中西南桦叶片不定根转化体系建立各阶段的生长及鉴定情况；图A：用于叶片取材的西南桦无性系组培苗的生长状态；图B：侵染后的西南桦带柄叶片在含选择剂和抑菌剂的不定根诱导固体平板培养基上培养15d时的生长状态；图C：转化根系的扫描电镜成像；图D：转化根系的荧光显微图片；图E：转基因株系全貌；图F：转基因株系全貌的荧光显微图片。
具体实施方式
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于西南桦叶片不定根发生的遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：以西南桦带柄叶片为转化受体，对所述转化受体进行预培养；所述转化受体经预培养之后再用含有根癌农杆菌的转化液进行侵染；对侵染后的叶片进行共培养；清洗共培养后的叶片；对清洗后的叶片进行不定根诱导培养；其中，所述根癌农杆菌中包含携带增强绿色荧光蛋白基因的表达载体。2.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，所述根癌农杆菌的菌株为GV3101，所述表达载体为pSAK277::eGFP；所述预培养培养基为含0.1mg/L～0.3mg/L NAA、15g/L～25g/L蔗糖、5g/L～7g/L琼脂的WPM培养基。3.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，所述转化液的OD
600
值为0.3～0.5，或/和，侵染时间为10min～15min。4.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，共培养条件包括：(1)避光培养；(2)共培养的培养基为MS培养基；(3)共培养时间为2d～4d；和，(4)共培养温度为23℃～25℃。5.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，共培养后的清洗方法为：(1)使用无菌水冲洗1遍；(2)使用浓度为500mg/L～1000mg/L的头孢噻肟钠水溶液浸洗1遍，浸洗时间为1min；(3)使用浓度为400mg/L～600mg/L的头孢噻肟钠水溶液再浸洗1遍，浸洗时间为1min；(4)无菌水冲洗2遍。6.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，所述不定根诱导...

【专利技术属性】
技术研发人员：王欢，王春胜，郭俊杰，尹海锋，曾杰，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院热带林业研究所，
类型：发明
国别省市：