一种油菜的基因瞬时过表达方法技术

本发明专利技术公开了一种油菜的基因瞬时过表达方法，属于生物技术领域。本发明专利技术通过巢式PCR扩增获得油菜的目的基因，并对目的基因加A后与表达载体进行连接，得到表达载体质粒，加入到感受态农杆菌中，筛选转入表达载体质粒的菌液，培养所得的菌液后离心，在沉淀菌体中加入侵染液并培养一段时间，从油菜苗叶片背面于脉络之间注射，培养一段时间后，检测油菜中目的基因的表达情况。本发明专利技术克服了现有的油菜基因表达方法所存在的操作困难、成本高、耗时长及转基因植株获得困难等方面的不足，能够高效的研究油菜基因功能，具有极大的应用前景。具有极大的应用前景。具有极大的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种油菜的基因瞬时过表达方法


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种植物瞬时过表达的方法，具体涉及农杆菌介导的油菜叶片瞬时过表达方法的建立。

技术介绍

[0002]目前已经有许多方法可以将外源基因稳定导入植物组织细胞，如农杆菌介导法、花粉管通道法、基因枪法、植物病毒载体介导、微注射法、电激法、化学法聚乙二醇(PEG)法等，这些技术均广泛应用于转基因和基因功能研究中。这些稳定转化涉及到遗传和筛选鉴定等，因此要持续数月甚至一年时间，耗时较长、操作复杂、实验成本高。而瞬时表达技术是在相对短的时间内将目标基因转入靶细胞，在细胞内建立暂时高效的表达系统，获得该目的基因短暂的高水平表达。与稳定表达相比，农杆菌介导瞬时表达所需时间短，可以在数天内快速表达外源基因，不需要将外源基因整合到宿主植物染色体中，操作简单、重复性高、实验成本低，因而已成为一种研究基因功能的有效方法。
[0003]油菜是世界第三和中国第一大油料作物，不仅是世界食用油和植物蛋白的重要来源，也是潜在的生物能源的原料。对油菜相关基因进行功能等方面快速和深入的研究，可为利用基因本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种油菜的基因瞬时过表达方法，其特征在于，主要包括以下步骤：(1)通过巢式PCR扩增获得油菜的目的基因，验证后，进行切胶回收，得到目的基因片段，并对目的基因片段进行加A反应，通过连接酶将得到的目的基因片段与表达载体pBI121
‑
GD进行连接，得到表达载体质粒；(2)制备感受态农杆菌，加入步骤(1)得到的表达载体质粒，在液氮中冷冻3
‑
10min，再于35
‑
39℃下静置3
‑
10min后加入LB培养基，于25
‑
30℃摇床培养1
‑
4h，筛选，进行PCR菌落验证，验证正确的菌液留存待用；(3)将步骤(2)的菌液培养到OD
600
为0.6
‑
0.8之间，离心，去上清，在沉淀菌体中加入侵染液并于25
‑
30℃摇床培养2
‑
5h；(4)将步骤(3)得到的菌液从油菜苗叶片背面于脉络之间注射，期间不可压破叶片，培养一段时间后，检测目的基因的表达情况。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的目的基因包括BnCMO基因和BnBADH基因。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的巢式PCR扩增条件为：94℃5min，94℃30s，60℃30s，72℃45s，72℃10min。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中PCR扩增的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1
‑
8所示。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中切胶回收的具体过程为：于装有胶块的EP管中加入600μL溶胶Buf...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘志文，孙小涵，李芙蓉，王晨晨，杨明煊，于放，张悦，高潇潇，金朝霞，
申请(专利权)人：大连工业大学，
类型：发明
国别省市：