一种提高体外骨软骨组织保存效果的超声刺激方法技术

本发明专利技术公开了一种提高体外骨软骨组织保存效果的超声刺激方法，属于软骨组织保存技术领域。所述方法包括以下步骤：体外获取动物或人的带软骨下骨的关节骨软骨组织置于含有组织培养液的无菌培养袋内，对骨软骨组织施加超声刺激，超声刺激方法为：按照刺激强度为0.1~3000mW/cm2、频率0.1~5MHz、占空比1%~60%，刺激时间为1~60min/次的组合参数，结合温度、气压等环境因素给予骨软骨组织每周2~5次的超声刺激。本发明专利技术提供的方法可显著提高体外保存期间的软骨细胞存活率及骨软骨组织的生物力学性能，通过激活自噬减少软骨细胞凋亡，提高保存效果，有利于提高骨软骨组织库利用率和临床软骨移植修复技术水平。骨移植修复技术水平。骨移植修复技术水平。

【技术实现步骤摘要】
一种提高体外骨软骨组织保存效果的超声刺激方法


[0001]本专利技术属于软骨组织保存
，具体为一种提高体外骨软骨组织保存效果的超声刺激方法。

技术介绍

[0002]近年来，随着大健康理念深入人心，越来越多的人加入到运动锻炼行列中，但随之也带来关节软骨损伤这一常见现象。然而，关节软骨损伤的修复治疗目前缺乏理想的治疗方法。因此，关节软骨损伤的修复治疗是临床上亟待解决的难题。同种异体骨软骨移植是将供体区的骨软骨组织移植到受体区缺损处，达到修复透明软骨，恢复软骨的生理和机械功能的目的。基础研究和临床研究已经证明，同种异体骨软骨移植是治疗软骨损伤（尤其是大面积软骨损伤）安全有效的治疗手段。然而，在我国同种异体骨软骨移植技术尚未广泛应用的瓶颈是国内尚未建立体外保存活性关节软骨技术。关节软骨在体外组织培养液中保存是一种常见并且十分有前景的组织库技术，然而，在缺乏力学刺激情况下骨软骨组织在组织培养液中体外保存1﹣2周软骨细胞存活率将显著下降，当软骨组织细胞存活率低于70%将会影响移植手术效果以及预后，因而限制了骨软骨组织移植临床应用。
[0003]关节软骨是载荷组织，在体内处于不断变化的力学环境中实现正常代谢，维持其生物学功能，而体外缺乏力学刺激必然会影响正常关节软骨的生理功能。
[0004]超声应用于医学领域历史悠久，研究表明，超声刺激能够影响体内软骨细胞的代谢活动，促进合成代谢功能，抑制其分解代谢功能。然而，超声刺激是否提高体外保存骨软骨组织的效果未见报道。

技术实现思路

[0005]为解决现有技术体外保存活性关节软骨1
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2周后软骨细胞存活率显著下降的问题，本专利技术提供一种提高体外骨软骨组织保存效果的超声刺激方法，在体外骨软骨组织保存过程中施加超声刺激，以实现提升体外组织培养保存软骨细胞活性和力学性能效果的目标，并建立了体外组织培养环境中提高软骨体外保存效果的超声刺激新方法。本专利技术提供的技术方法如下所述：作为本专利技术的第一个目的，在于提供一种提高体外骨软骨组织保存效果的超声刺激方法，包括以下步骤：步骤一：体外获取动物或人的带软骨下骨的关节骨软骨组织；步骤二：将体外获取的带软骨下骨的关节骨软骨组织置于组织培养液中，对骨软骨组织施加超声刺激；超声刺激方法为：按照刺激强度为0.1~3000mW/cm2、频率0.1~5MHz、占空比1%~60%，刺激时间为1~60min/次的组合参数，给予骨软骨组织每周2~5次的超声刺激，将骨软骨组织于体外环境中保存；所述超声刺激方法所需的环境是：无菌条件，温度控制在0~37℃，1个标准大气压。
[0006]优选的，采用超声刺激装置对骨软骨组织施加超声刺激，所述超声刺激装置选自
超声波治疗仪超声波治疗仪、超声电刺激治疗仪、超声波理疗仪和超声电疗仪。
[0007]软骨组织细胞存活率是一项公认的检测软骨活性的指标，杨氏模量是检测骨软骨组织力学性能的公认指标，也是组织库产品质量重要指标之一。
[0008]优选的，所述方法还包括步骤三：超声刺激后，对骨软骨组织在第1天、7天、14天、21天、28天、35天、42天、49天检测软骨细胞存活率、蛋白多糖含量和骨软骨组织的杨氏模量，评价超声刺激对骨软骨组织的作用及效果。优选的，步骤一中，骨软骨组织取材方法为，无菌取材来自大动物或捐赠的人体四肢关节软骨，所述骨软骨组织取材自非活体大动物或捐赠的人体四肢关节软骨；所述关节软骨为带有长度6.0~28.0mm软骨下骨的骨软骨复合体，可以为骨软骨柱或关节端完整骨软骨块；所述骨软骨组织取材部位为关节面的负重区。
[0009]更优选的，步骤一中，骨软骨组织取材的具体操作方法为：遵照无菌原则将离体四肢关节固定于手术台上，切开关节，暴露关节面，选取关节面负重区取材，PBS冲洗后放入无菌培养袋中；更进一步的，步骤一中取材获得的无菌骨软骨组织为骨软骨柱或关节端完整骨软骨块。其中，骨软骨柱的规格为长度7.0~15.0mm，直径4.5~15mm。
[0010]在临床应用中，一般在受体关节用环形钻取相应大小的骨软骨柱，然后在软骨损伤区做相同大小的骨隧道，将骨软骨柱打入到骨隧道内，然而，在软骨大面积损伤或多发部位损伤情况下，受体损伤区域为不规则形状，骨软骨柱的使用受限，基于本专利技术提供的技术，采用关节端完整的骨软骨块在超声刺激保存后，可在使用前将骨软骨块修剪为合适形状大小的骨软骨组织，以适应受体损伤区域。然而该处理过程对供体移植物的强度有较高要求，现有技术保存后的骨软骨其生物力学性能随时间延长而降低，在研究中，专利技术人惊讶地发现，通过本专利技术提供的方法进行超声处理，对完整骨软骨块的保存也具有良好的效果，可延缓骨软骨组织生物力学性能的降低，采用本专利技术方法保存后的完整骨软骨块可经修剪后，可以满足不规则形状的受体损伤区域损伤移植修复的需要。
[0011]体内软骨组织主要依靠细胞外基质抵抗压缩力和剪切力，细胞外基质结构和功能的完整性是保证软骨生物力学性能的基础，良好的生物力学性能保证关节软骨承受载荷能力。细胞外基质的主要成分是Ⅱ型胶原和蛋白多糖，蛋白多糖含量的高低反映了细胞外基质的成分高低，延缓蛋白多糖含量降低，对于细胞外基质抵抗压缩力和剪切力至关重要。
[0012]在本专利技术提供的实施例中，经超声处理后的骨软骨柱或者关节端完整骨软骨块的蛋白多糖含量和杨氏模量降低速率低于静态组，可见本专利技术提供的超声刺激方法延缓了骨软骨组织力学性能降低的速率，可保证更长保存时间内骨软骨组织的力学强度，骨软骨柱可承受力敲入受体孔洞内，或者大块的骨软骨块可进行修剪后使用。
[0013]优选的，步骤二中所述组织培养液选自DMEM培养液、EMEM培养液和TSMU培养液，DMEM培养液和EMEM培养液为市售的常用组织、细胞培养培养液，作为优选的实施例，本专利技术使用了TSMU培养液；所述TSMU培养液成分为：每1000ml所述培养液包括，葡萄糖80~125mmol、氨基酸0.1~2.0mmol、抗氧化剂0.2~2.0mmol、碱性成纤维细胞生长因子5~60nmol、无机盐1~120mmol、维生素1~9mmol、丙酮酸钠1~2mmol、青霉素50~70U、余去为离子水。无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化钙中的一种或几种组合。所述TSMU培养液为已公开的中国专利申请“一种骨软骨移植物保存液极其制备方法”（申请号为201510093497.0）中所述骨软骨
移植物保存液。所述TSMU培养液在基础培养液的基础上添加抗氧化等成分，在4℃保存条件下，较基础培养液能有效提高软骨体外保存效果。
[0014]由于培养液和保存条件的不同，不同温度下，软骨组织的保存效果也不同，而本专利技术方法在4℃、25℃和37℃下均具有良好的保存效果。
[0015]更优选的，步骤二中超声刺激骨软骨组织的具体操作方法为：将体外获取的带软骨下骨的关节软骨组织置于含有组织培养液的无菌培养袋内，将超声刺激装置的超声探头上均匀地涂抹医用耦合剂，设置超声刺激参数，开启超声，手动匀速的以1~5mm/s的速度在无菌培养袋表面移动超声探头，超本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高体外骨软骨组织保存效果的超声刺激方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：体外获取动物或人的带软骨下骨的关节骨软骨组织；步骤二：将体外获取的带软骨下骨的关节骨软骨组织置于组织培养液中，对骨软骨组织施加超声刺激；超声刺激方法为：按照刺激强度为0.1~3000mW/cm2、频率0.1~5MHz、占空比1%~60%，刺激时间为1~60min/次的组合参数，给予骨软骨组织每周2~5次的超声刺激，将骨软骨组织于体外环境中保存；所述超声刺激方法所需的环境是：无菌条件，温度控制在0~37℃，1个标准大气压。2.根据权利要求1所述的一种提高体外骨软骨组织保存效果的超声刺激方法，其特征在于，采用超声刺激装置对骨软骨组织施加超声刺激，所述超声刺激装置选自超声波治疗仪、超声电刺激治疗仪、超声波理疗仪和超声电疗仪。3.根据权利要求1所述的一种提高体外骨软骨组织保存效果的超声刺激方法，其特征在于，所述方法还包括步骤三：超声刺激后，对骨软骨组织在第1天、7天、14天、21天、28天、35天、42天、49天检测软骨细胞存活率、蛋白多糖含量和骨软骨组织的杨氏模量，评价超声刺激对骨软骨组织的作用及效果。4.根据权利要求1所述的一种提高体外骨软骨组织保存效果的超声刺激方法，其特征在于，步骤一中，骨软骨组织取材的具体操作方法为：遵照无菌原则将离体四肢关节固定于手术台上，切开关节，暴露关节面，选取关节面负重区取材，PBS冲洗后放入无菌培养袋中；所述骨软骨组织取材自非活体大动物或捐赠的人体四肢关节软骨；所述关节软骨为带有长度6.0~28.0mm软骨下骨的骨软骨复合体。5.根据权利要求1所述的一种提高体外骨软骨组织保存效果的超声刺激方法，其特征在于，步骤一中取材获得的无菌骨软骨组织为骨软骨柱或关节端完整骨软骨块；其中，骨软骨柱的规格为长度7.0~15.0mm，直径4.5~15mm。6....

【专利技术属性】
技术研发人员：亓建洪，董军，宋洪强，华真，郑茂坤，焦颖，周路，
申请(专利权)人：山东第一医科大学山东省医学科学院，
类型：发明
国别省市：