微量样本中外泌体及其RNA的快速提取试剂盒及提取方法技术

本发明专利技术公开了微量样本中外泌体及其RNA的快速提取试剂盒及提取方法。本发明专利技术基于免疫亲和捕获技术快速提取外泌体和外泌体RNA，突破现有的技术瓶颈，能从100μL微量样本中高效纯化外泌体，减少外泌体损耗，获取的外泌体纯度高，同时富集于板孔的外泌体可进一步原位进行RNA提取，克服了操作步骤繁琐，并易降解的技术挑战，提高了RNA的产量。本发明专利技术具有样本需求量低、纯度高、稳定性好、效率高、成本低、不需要特殊的仪器设备等优势，为外泌体相关的分子水平研究提供了稳定可靠的技术支持。研究提供了稳定可靠的技术支持。研究提供了稳定可靠的技术支持。

【技术实现步骤摘要】
微量样本中外泌体及其RNA的快速提取试剂盒及提取方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及外泌体及外泌体RNA的提取。

技术介绍

[0002]外泌体(EV)是一种由多种细胞分泌于体液中的纳米级囊泡。它的产生过程涉及到细胞膜内陷，形成包含腔内囊泡的细胞内多囊泡体(MVBs)，最后MVBs与质膜融合后释放于细胞外环境中。这些外泌体内含有不同类型的蛋白质、脂质、RNA、DNA等物质，介导细胞间的信息传递，在调节免疫、炎症、细胞和组织再生等过程中发挥重要的作用。
[0003]其中，外泌体RNA的检测在医药领域有重要应用价值。外泌体中包括有多种RNA，如miRNA，碎片或完整的mRNA、核糖体RNA(rRNA)和长非编码RNA(lncRNA)分子等。研究发现，这些RNA可能通过促进细胞迁移、侵袭、集落形成、血管再生、免疫抑制、抑制细胞凋亡、促进血管生成、调节自噬等机制促进肿瘤的发生、侵袭以及增加耐药性。例如，来自缺氧肺癌细胞的外泌体miR
‑
23a可以增加血管生成和血管通透性，进而可能促进肿瘤细胞的发生；外泌体mir
‑
20b
‑
5p和mir
‑
3187
‑
5p与NSCLC相关；外泌体miR
‑
26a
‑
5p的缺失可能有助于子宫内膜癌淋巴管生成和淋巴转移。因此，基于外泌体RNA的液体活检有望成为未来医学的关键突破点。
[0004]然而，外泌体RNA检测技术临床转化的主要限速步骤是迄今为止缺乏高效的外泌体RNA提取方法。目前常见的方法，如超速离心法，包括差速离心和密度梯度离心，是最经典的外泌体提取方法。但是这些方法无法实现临床转化的主要问题是需要的样本量大。通常单次检测需要10mL以上的采血量才能提取到常规逆转录需要的RNA量。此外，提取所得外泌体溶液易混有各种杂质，目前这种方法仅适用于脂蛋白、囊外蛋白复合物、聚集物和其他物质，而且RNA检测结果不稳定。磁珠吸附法可通过外泌体靶标抗体实现对外泌体亚群的高效捕获。此外，沉淀法的操作简单，无需特殊的技术及设备，产量高，可用于下游分析试验，但因可能会沉淀非外泌体的疏水物质及其他蛋白，获得的外泌体纯度不高。超滤法，包括基于大小的过滤、尺寸排除色谱和聚合物沉淀，是基于大小的外泌体分离方法，通过定义分子量或大小排除限制的膜过滤器来分离得到外泌体；以及基于微流体的外泌体分离技术，是对于外泌体的微尺度分离、检测和分析的必要和重要的技术。但以上技术的临床转化，仍有成本较高、需要配套的仪器设备、回收率低、速度慢等缺点和问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供了微量样本中外泌体及其RNA的快速提取试剂盒及提取方法，以解决目前外泌体RNA检测样本需采集量过大、操作繁琐易被RNase降解、提取得到的RNA浓度和纯度不佳等问题。由此，为今后的研究提供稳定可靠的技术和数据支持。
[0006]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案之一是：
[0007]一种外泌体的提取试剂盒，所述试剂盒包括包被了外泌体捕获抗体的微孔板，所述微孔板上具有三层聚合物涂层，所述三层聚合物为羧化PAMAM树枝状聚合物
‑
PEG混合物
‑
羧化PAMAM树枝状聚合物，在所述三层聚合物上结合有外泌体捕获抗体。
[0008]进一步地，所述三层聚合物涂层即羧化PAMAM树枝状聚合物
‑
PEG混合物
‑
羧化PAMAM树枝状聚合物，通过以下方法制备得到：
[0009]1)用部分羧化的PAMAM树枝状聚合物涂覆环氧基修饰的微孔板；
[0010]2)将1～3kDa甲氧基
‑
PEG
‑
胺(mPEG)、4～6kDa羧基
‑
PEG
‑
胺和18～22kDa羧基
‑
PEG
‑
胺加入至步骤1)所得产物中，使三种PEG形成的PEG(聚乙二醇)混合物与PAMAM和剩余的环氧基形成共轭；
[0011]3)在步骤2)所得产物中再次加入部分羧化的PAMAM树枝状聚合物，在所述微孔板上形成羧化PAMAM树枝状聚合物
‑
PEG混合物
‑
羧化PAMAM树枝状聚合物的三层聚合物涂层结构。
[0012]进一步地，在制备三层聚合物涂层的过程中，需要采用EDC和NHS等进行活化。
[0013]进一步地，所述1～3kDa的甲氧基
‑
PEG
‑
胺、4～6kDa的羧基
‑
PEG
‑
胺和18～22kDa羧基
‑
PEG
‑
胺的质量比为45～50:1:1。
[0014]进一步地，将PAMAM树状大分子与丁二酸酐在二甲亚砜中反应进行胺基羧化，得到所述羧化的PAMAM树枝状聚合物。具体地，PAMAM树状大分子用磷酸盐缓冲盐水和水纯化后，按照PAMAM树状大分子与丁二酸酐的质量比为1：0.30～0.35的比例在DMSO中反应过夜(例如为10～15h)，得到所述部分羧化的PAMAM树枝状聚合物。
[0015]进一步地，在微孔板的三层聚合物上结合的所述外泌体捕获抗体为特异性抗人总外泌体相关抗原的单克隆抗体，例如包括抗CD63抗体、抗CD9抗体或抗CD81抗体中的至少一种。
[0016]进一步地，所述包被了外泌体捕获抗体的微孔板通过以下方法制备得到：将外泌体捕获抗体用EDTA和半胱胺酸盐酸处理后得到修饰抗体，将修饰抗体加入至经过Tween
‑
20处理且经SMCC活化后的具有三层聚合物涂层的微孔板中，孵育完成外泌体捕获抗体的耦联，洗板，用BSA封闭，洗涤，即得。再用于外泌体捕获。
[0017]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案之二是：
[0018]一种外泌体RNA的提取试剂盒，所述试剂盒包括包被了外泌体捕获抗体的微孔板，还包括RNA抽提试剂；所述微孔板上具有三层聚合物涂层，所述三层聚合物为羧化PAMAM树枝状聚合物
‑
PEG混合物
‑
羧化PAMAM树枝状聚合物，在所述三层聚合物上结合有外泌体捕获抗体。
[0019]进一步地，所述三层聚合物涂层即羧化PAMAM树枝状聚合物
‑
PEG混合物
‑
羧化PAMAM树枝状聚合物，通过以下方法制备得到：
[0020]1)用部分羧化的PAMAM树枝状聚合物涂覆环氧基修饰的微孔板；
[0021]2)将1～3kDa甲氧基
‑
PEG
‑
胺、4～6kDa羧基
‑
PEG
‑
胺和18～22kDa羧基
‑
PEG
‑
胺加入至步骤1)所得产物中，使三种PEG形成的PEG混合物与PAMAM和剩余的环氧基形成共轭；...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种外泌体的提取试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括包被了外泌体捕获抗体的微孔板，所述微孔板上具有三层聚合物涂层，所述三层聚合物为羧化PAMAM树枝状聚合物
‑
PEG混合物
‑
羧化PAMAM树枝状聚合物，在所述三层聚合物上结合有所述外泌体捕获抗体。2.一种外泌体RNA的提取试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括包被了外泌体捕获抗体的微孔板，还包括RNA抽提试剂；所述微孔板上具有三层聚合物涂层，所述三层聚合物为羧化PAMAM树枝状聚合物
‑
PEG混合物
‑
羧化PAMAM树枝状聚合物，在所述三层聚合物上结合有所述外泌体捕获抗体。3.根据权利要求1或2所述的提取试剂盒，其特征在于：所述羧化PAMAM树枝状聚合物
‑
PEG混合物
‑
羧化PAMAM树枝状聚合物的三层聚合物涂层通过以下方法制备得到：1)用羧化的PAMAM树枝状聚合物涂覆环氧基修饰的微孔板；2)将1～3kDa甲氧基
‑
PEG
‑
胺、4～6kDa羧基
‑
PEG
‑
胺和18～22kDa羧基
‑
PEG
‑
胺加入至步骤1)所得产物中，使三种PEG形成的PEG混合物与PAMAM和剩余的环氧基形成共轭；3)在步骤2)所得产物中再次加入羧化的PAMAM树枝状聚合物，在所述微孔板上形成羧化PAMAM树枝状聚合物
‑
PEG混合物
‑
羧化PAMAM树枝状聚合物的三层聚合物涂层结构。4.根据权利要求3所述的提取试剂盒，其特征在于：所述1～3kDa甲氧基
...

【专利技术属性】
技术研发人员：兰天舒，林真亭，周博轩，林榕，陈梓悦，吴雪梅，黄连江，萧晨路，
申请(专利权)人：厦门医学院，
类型：发明
国别省市：