一种基于免疫-核酸CHA的荧光传感系统检测IGFBP-7的方法与应用技术方案

本发明专利技术涉及一种双抗夹心原理结合核酸探针自组装信号放大法检测抗人胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP

【技术实现步骤摘要】
一种基于免疫
‑
核酸CHA的荧光传感系统检测IGFBP
‑
7的方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物领域，具体涉及一种检测肾损伤标志物IGFBP
‑
7的方法。

技术介绍

[0002]急性肾损伤(Acute kidney injury，AKI)是临床常见的一种急症，可由多种因素引起，包括心力衰竭、脓毒症、出血、肾毒性药物等，主要表现为肾功能骤然下降，从而引起氮质与肌酐等代谢产物的潴留，具有较高的发病率与死亡率。AKI的早期诊断可为其治疗提供了一个关键的治疗时间窗，以防止进展为慢性肾衰竭。目前临床上主要依据患者血清肌酐值和尿量的变化作为急性肾损伤的金标准。但是血清肌酐和尿量容易受到年龄和体重等多种因素的影响往往延迟升高，不能及时反应肾脏损伤情况，对早期AKI的诊断并不十分有效。
[0003]近年来，随着信息技术、纳米技术和生物医学的发展，研究人员发现了许多可用于AKI早期诊断的新型生物标志物，其中人胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP
‑
7)作为一种新型的AKI早期生物标志物，有着优于传统指标的准确性。因此开发一种可靠的用于检测AKI早期生物标志物(IGFBP
‑
7)的方法具有重要的意义。
[0004]目前已开发的用于检测AKI的方法主要采取免疫学方法中酶联免疫吸附法(ELISA)。尽管ELISA作为一种成熟的检测技术之一，具有灵敏度高、特异性强的特点，但其在最后进行显色时结果稳定较差，所以简单、稳定的AKI早期生物标志物的检测方法对于AKI的诊断仍具有良好的前景。
[0005]催化发夹组装反应是一种等温、无酶的扩增反应技术。通过特定的触发链，催化两个定制的发夹发生自组装，产生丰富稳定的双链信号读数，常被用于目标分子的扩增检测。这种等温核酸扩增方法可以在较低的温度下进行，不需要热循环和精确的温度控制，并且可以在相对较短的时间内实现高水平的信号放大。
[0006]目前临床应用方面亟需开发了一种特异性高、灵敏度高、稳定性好的IGFBP
‑
7检测方法，本领域暂未见将抗原
‑
抗体特异性识别与核酸催化发夹组装反应相结合用于IGFBP
‑
7检测的相关文献报道。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种基于免疫
‑
核酸CHA的荧光传感系统检测IGFBP
‑
7的方法，以解决上述
技术介绍
中提到的问题。
[0008]为实现上述目的，本专利技术的第一方面提供一种基于免疫
‑
核酸CHA的荧光传感系统定量检测IGFBP
‑
7的方法，该方法包括以下步骤：
[0009](1)将待测样本进行低速离心，取上清作为待测溶液；
[0010](2)将待测溶液加入到IGFBP
‑
7抗体1包被的酶标孔板中，充分混合反应后，通过清洗去除多余成分后得到组份A；
[0011](3)取等体积的生物素标记的IGFBP
‑
7抗体2、链霉亲和素以及生物素标记的DNA引物，混合后室温放置，然后将混合物加入组份A中，充分混合反应后，通过清洗去除多余成分后得到组份B；
[0012](4)向组份B中加入DNA发夹探针AP1、DNA发夹探针AP2以及缓冲液，充分混合反应后，直接检测所得溶液的荧光信号；
[0013](5)基于荧光信号值与IGFBP
‑
7浓度之间的线性关系计算待测溶液中IGFBP
‑
7的含量。
[0014]优选的，所述步骤(1)中的待测样本为人体血液或尿液。
[0015]优选的，所述步骤(2)中的反应温度为30
‑
40℃，反应时间为60
‑
120min。
[0016]更优选的，所述步骤(2)中的反应温度为37℃，反应时间为90min。
[0017]优选的，所述步骤(2)中IGFBP
‑
7抗体1为IGFBP
‑
7羊单克隆抗体。
[0018]优选的，所述步骤(3)中生物素标记的IGFBP
‑
7抗体2、链霉亲和素以及生物素标记的DNA引物混合后室温放置1小时。
[0019]优选的，所述步骤(3)中生物素标记的IGFBP
‑
7抗体2、链霉亲和素以及生物素标记的DNA引物混合的浓度比为1：1：(1
‑
3)。
[0020]更优选的，所述步骤(3)中加入生物素标记的IGFBP
‑
7抗体2、链霉亲和素以及生物素标记的DNA引物的浓度比为1：1：2。
[0021]优选的，所述步骤(3)中生物素标记的IGFBP
‑
7抗体2为生物素标记的IGFBP
‑
7兔单克隆抗体。
[0022]优选的，所述步骤(3)中生物素标记的DNA引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0023]5’‑
TAGCTTATCAGACTGATGTTGATTTTTTTTTT
‑3’
(SEQ ID NO.1)。
[0024]优选的，所述SEQ ID NO.1序列的3
’
端修饰有生物素(Biotin)，3
’
端的修饰位置碱基以下划线表示。
[0025]优选的，所述步骤(3)中的反应温度为30
‑
40℃，反应时间为30
‑
90min。
[0026]更优选的，所述步骤(3)中的反应温度为37℃，反应时间为60min。
[0027]优选的，所述步骤(4)中的DNA发夹探针AP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0028]5’‑
TCAACATCAGTCTGATAAGCTAGATGTTGAAACCTAGCTAGCTTATCAGACT
‑3’
(SEQ ID NO.2)。
[0029]优选的，所述SEQ ID NO.2序列的5
’
端修饰有荧光淬灭基团，3
’
端修饰有荧光基团，其中5
’
端和3
’
端的修饰位置碱基以下划线表示。
[0030]优选的，所述荧光淬灭基团为4
‑
二甲胺偶氮苯
‑4’‑
羧酸(DABCYL)，所述荧光基团为FAM。
[0031]优选的，所述步骤(4)中的DNA发夹探针AP2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0032]5’‑
TAAGCTAGCTAGGTTTCAACATCTAGCTTATCAGAGAGATGTTGAAACCTAG CCCTT
‑3’
(SEQ ID NO.3)。
[0033]优选的，所述步骤(4)中的反应温度为30
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于免疫
‑
核酸CHA的荧光传感系统定量检测IGFBP
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7的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)将待测样本进行低速离心，取上清作为待测溶液；(2)将待测溶液加入到IGFBP
‑
7抗体1包被的酶标孔板中，充分混合反应后，通过清洗去除多余成分后得到组份A；(3)取等体积的生物素标记的IGFBP
‑
7抗体2、链霉亲和素以及生物素标记的DNA引物，混合后室温放置，然后将混合物加入组份A中，充分混合反应后，通过清洗去除多余成分后得到组份B；(4)向组份B中加入DNA发夹探针AP1、DNA发夹探针AP2以及缓冲液，充分混合反应后，直接检测所得溶液的荧光信号；(5)基于荧光信号值与IGFBP
‑
7浓度之间的线性关系计算待测溶液中IGFBP
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7的含量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中生物素标记的DNA引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中的DNA发夹探针AP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟晓明，王杰，臧洪梅，陈玉红，庾聚涛，王伟，金娟，温家根，杨雅茹，
申请(专利权)人：安徽医科大学，
类型：发明
国别省市：