报告磁珠及其制备方法和应用、检测试剂盒以及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种报告磁珠、报告磁珠的制备方法、上述报告磁珠在核酸检测领域的应用、包括该报告磁珠的检测试剂盒以及一种采用上述报告磁珠的检测方法。报告磁珠基于CRISPR技术，包括依次连接的磁珠、单链核酸和酶，所述磁珠和所述单链核酸之间通过

【技术实现步骤摘要】
报告磁珠及其制备方法和应用、检测试剂盒以及检测方法


[0001]本专利技术涉及生物检测
，尤其是涉及一种报告磁珠及其制备方法和应用、检测试剂盒以及检测方法。

技术介绍

[0002]CRISPR技术，即CRISPR核酸检测技术，其可以用于植物、动物、微生物、病毒等来源的DNA或RNA分子的检测。CRISPR/Cas体系对核酸具有高选择性和特异性，可以检测到仅一个碱基的突变。
[0003]CRISPR/Cas系统由可轻松编程的引导RNA(crRNA)和Cas蛋白组成，可以根据crRNA与目标序列特异性互补来顺式切割靶标DNA或RNA。除了特异性结合和顺式切割靶标分子外，一些Cas蛋白(包括Cas12和Cas13等)的反式切割活性也被发现。即在Cas
‑
crRNA复合物与靶标结合后激活反式切割活性，对附近非靶标的单链DNA或RNA进行无差异的切割。这种机制可以被用于裂解外源性引入的、自猝灭的荧光DNA或RNA报告体，并且具有极高周转率，从而实现信号放大。该现象被发现之后，基于CRISPR/Cas的新型诊断技术被广泛开发并用于核酸检测。
[0004]目前，基于CRISPR技术的核酸检测方法，通常在电极上结合带有高催化活性酶的核酸，Cas
‑
crRNA复合物与待测靶标结合后置于电极表面，Cas
‑
crRNA复合物激活反式切割活性后对单链核酸进行切割，一定时间后清洗并加入催化底物，一定时间后检测电极上的电信号，实现对待测靶标的检测。
[0005]然而，上述检测方法受限于电极的平面特性，连接在电极上的单链核酸彼此之间容易因为位置阻碍，导致切割位点被阻挡，特别是当电极上连接的单链核酸较长时，上述情况更容易发生。

技术实现思路

[0006]基于此，有必要提供一种可以解决上述问题的基于CRISPR技术的报告磁珠。
[0007]此外，还有必要提供一种上述报告磁珠的制备方法、上述报告磁珠在核酸检测领域的应用、包括该报告磁珠的检测试剂盒以及一种采用上述报告磁珠的检测方法。
[0008]一种报告磁珠，基于CRISPR技术，包括依次连接的磁珠、单链核酸和酶，所述磁珠和所述单链核酸之间通过
‑
COO
‑
NH
‑
连接。
[0009]在一个实施例中，所述磁珠上连接有
‑
COOH，所述单链核酸的3
’
端连接有
‑
(CH2)
n
‑
NH2，所述磁珠和所述单链核酸通过
‑
COO
‑
NH
‑
(CH2)
n
连接，其中，n为6～20的自然数。
[0010]在一个实施例中，所述单链核酸的5
’
端连接有
‑
三甘醇
‑
生物素，所述酶上连接有链霉亲和素，所述报告磁珠的结构为：磁珠
‑
COO
‑
NH
‑
(CH2)
n
‑
单链核酸
‑
三甘醇
‑
生物素
‑
链霉亲和素
‑
酶。
[0011]在一个实施例中，所述磁珠为二氧化硅磁珠或聚苯乙烯磁珠，所述磁珠的粒径为100nm～100μm。
[0012]在一个实施例中，所述单链核酸的序列如SEQ ID NO.1所示或如SEQ IDNO.2所示。
[0013]一种上述的报告磁珠的制备方法，包括如下步骤：
[0014]提供磁珠、单链核酸和酶，所述磁珠的表面连接有
‑
COOH，所述单链核酸的3
’
端连接有
‑
(CH2)
n
‑
NH2，所述单链核酸的5
’
端连接有
‑
三甘醇
‑
生物素，所述酶上连接有链霉亲和素，其中，n为6～20的自然数；
[0015]将所述磁珠分散到活化缓冲液中，并依次加入EDC溶液和NHS溶液，混匀后充分反应，接着进行第一次磁分离并保留第一沉淀，所述第一沉淀即为活化后的所述磁珠；
[0016]用偶联缓冲液对活化后的所述磁珠进行清洗和重悬，接着加入所述单链核酸，混匀后充分反应，接着进行第二次磁分离并保留第二沉淀，所述第二沉淀即为半成品，所述半成品包括依次连接的所述磁珠和所述单链核酸，所述磁珠和所述单链核酸通过
‑
COO
‑
NH
‑
(CH2)
n
连接；
[0017]用封闭缓冲液对所述半成品进行封闭；
[0018]用保存缓冲液对封闭后的所述半成品进行清洗和重悬，接着加入所述酶，混匀后充分反应，接着进行第三次磁分离并保留第三沉淀，所述第三沉淀即为所需要的报告磁珠，所述报告磁珠的结构为：磁珠
‑
COO
‑
NH
‑
(CH2)
n
‑
单链核酸
‑
三甘醇
‑
生物素
‑
链霉亲和素
‑
酶。
[0019]一种上述的报告磁珠，在核酸检测领域的应用。
[0020]一种检测试剂盒，包括上述的报告磁珠。
[0021]一种检测方法，包括如下步骤：
[0022]将待测靶标、Cas试剂以及上述的报告磁珠在电极表面混匀，经过第一时间后，进行磁分离并保留沉淀；
[0023]用清洗缓冲液对所述沉淀进行清洗，磁分离去除上清并加入催化底物，经过第二时间反应后进行电化学信号检测。
[0024]一种检测方法，包括如下步骤：
[0025]将待测靶标、Cas试剂以及上述的报告磁珠在液相体系中混匀，经过第一时间后，进行磁分离并保留沉淀；
[0026]用清洗缓冲液对所述沉淀进行清洗，磁分离去除上清并加入催化底物，去除磁场并混匀，经过第二时间后，终止反应，得到反应混合物；
[0027]对所述反应混合物的进行光学信号检测。
[0028]本专利技术的报告磁珠基于CRISPR技术，包括依次连接的磁珠、单链核酸和酶，磁珠具有高比表面积、单分散性可控粒径等特点，磁珠上连接的单链核酸具有更大的空间伸展，不容易因为位置阻碍，导致切割位点被阻挡。相比于传统的电极的方案，磁珠表面可修饰更长的单链核酸来暴露更多切割位点。
[0029]此外，传统的方案中，电极上连接的长序列单链核酸时，还会有电子传输距离变长，电信号偏低的问题，而本专利技术中，在磁珠上连接长序列单链核酸，可以通过磁吸将磁珠聚集在电极表面，保证较短的电信号传递距离，从而可以在连接长序列单链核酸时，有效的提高了电信号的强度。
附图说明
[0030]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现
有技术描述中所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种报告磁珠，基于CRISPR技术，其特征在于，包括依次连接的磁珠、单链核酸和酶，所述磁珠和所述单链核酸之间通过
‑
COO
‑
NH
‑
连接。2.根据权利要求1所述的报告磁珠，其特征在于，所述磁珠上连接有
‑
COOH，所述单链核酸的3
’
端连接有
‑
(CH2)
n
‑
NH2，所述磁珠和所述单链核酸通过
‑
COO
‑
NH
‑
(CH2)
n
连接，其中，n为6～20的自然数。3.根据权利要求2所述的报告磁珠，其特征在于，所述单链核酸的5
’
端连接有
‑
三甘醇
‑
生物素，所述酶上连接有链霉亲和素，所述报告磁珠的结构为：磁珠
‑
COO
‑
NH
‑
(CH2)
n
‑
单链核酸
‑
三甘醇
‑
生物素
‑
链霉亲和素
‑
酶。4.根据权利要求3所述的报告磁珠，其特征在于，所述磁珠为二氧化硅磁珠或聚苯乙烯磁珠，所述磁珠的粒径为100nm～100μm。5.根据权利要求1～4中任意一项所述的报告磁珠，其特征在于，所述单链核酸的序列如SEQ ID NO.1所示或如SEQ ID NO.2所示。6.一种如权利要求3所述的报告磁珠的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：提供磁珠、单链核酸和酶，所述磁珠的表面连接有
‑
COOH，所述单链核酸的3
’
端连接有
‑
(CH2)
n
‑
NH2，所述单链核酸的5
’
端连接有
‑
三甘醇
‑
生物素，所述酶上连接有链霉亲和素，其中，n为6～20的自然数；将所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑峰，张健，徐勇，李俊，曾淮扬，
申请(专利权)人：深圳市第二人民医院深圳市转化医学研究院无锡吐露港生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：