本发明专利技术公开了一种产肠毒素大肠埃希氏菌的鉴定方法。属于食品安全检测技术领域。该方法的具体步骤如下：培养目标菌，提取可疑菌落全基因组DNA；利用不对称聚合酶链式反应技术制备带有标记物的uidA、lt和sth目标基因单链DNA；采用带颜色的微球标记可识别uidA、lt和sth基因的单链DNA序列，制备检测探针；将具有可识别标记物的蛋白喷涂于硝酸纤维膜上制备检测试纸条；将不对称聚合酶链式反应产物与检测探针混匀，利用检测试纸条进行检测。该方法具有准确度高、灵敏度强、重复性好以及低检测成本诸多优点。成本诸多优点。成本诸多优点。
【技术实现步骤摘要】
一种产肠毒素大肠埃希氏菌的鉴定方法
[0001]本专利技术涉及食品安全检测
，更具体的说是涉及一种产肠毒素大肠埃希氏菌的鉴定方法。
技术介绍
[0002]产肠毒素大肠埃希氏菌(ETEC)，是一类引起人和幼畜腹泻的重要病原菌。ETEC易污染污染的水或绿叶蔬菜而被感染。迅速确定ETEC的污染来源可有效缩小疫情的范围，而建立简便高效的ETEC检测方法是控制疫情的关键。
[0003]目前针对于ETEC的检测方法可分为3类：传统培养法、免疫学检测法和分子生物学法。传统培养法需要对ETEC进行分型培养以及生理生化鉴定，操作步骤繁琐且检测周期较长，一般需要4
‑
7天。酶联免疫吸附技术和免疫层析技术是免疫学检测法的两个主要检测手段。免疫学检测法是基于ETEC菌体表面特异性抗原(O、H抗原)的不同，通过抗原抗体间特异性识别而达到鉴定的目的，操作简单快速，但其检测范围狭窄，只能检测特定血清型的ETEC，抗体制备成本高，且容易存在一定的假阳性率。分子生物学法主要依靠聚合酶链式反应技术对ETEC的标志性毒力基因uidA、lt和sth进行识别。基于聚合酶链式反应技术的分子生物学法检测手段众多，可满足不同的实验需求，且检测技术效果好，特异性强，检出阳性率高，但大多数方法的检测结果判读依赖于荧光定量聚合酶链式反应仪，成本较高，不能直观地对结果进行判定。其他一些依赖于核酸电泳进行结果判定的检测技术虽然成本不高，但有些基因片段大小相近，导致无法准确辨别目的条带。
[0004]综上，如何提供一种灵敏度高、准确性好、检测时间短、操作简便的产肠毒素大肠埃希氏菌的鉴定方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
[0005]有鉴于此，本专利技术提供了一种产肠毒素大肠埃希氏菌的鉴定方法。该方法灵敏高、检测时间短、操作简便并可以从基因层面准确地鉴定产肠毒素大肠埃希氏菌。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]一种产肠毒素大肠埃希氏菌的鉴定方法，包括如下步骤：
[0008](1)培养目标菌，提取目标菌全基因组DNA；
[0009](2)以提取的目标菌全基因组DNA为模板，进行多重不对称聚合酶链式反应，所需引物序列如下：
[0010]lt
‑
F：GAACAGGAGGTTTCTGCGTTAGGTG；SEQ ID No.1；
[0011]lt
‑
R：CTTTCAATGGCTTTTTTTTGGGAGTC；SEQ ID No.2；
[0012]sth
‑
F：TGTCTTTTTCACCTTTCGCTC；SEQ ID No.3；
[0013]sth
‑
R：CGGTACAAGCAGGATTACAACAC；SEQ ID No.4；
[0014]uidA
‑
F：GCGAGGTACGGTAGGAGTTG；SEQ ID No.5；
[0015]uidA
‑
R：TCACAGCCAAAAGCCAGACA；SEQ ID No.6；
[0016]并且上述uidA下游引物(uidA
‑
R)5
’
端标记地高辛，lt和sth下游引物(lt
‑
R和sth
‑
R)5
’
端标记生物素；
[0017](3)采用带颜色的微球标记可识别uidA、lt和sth目标基因的DNA序列，获得检测探针；
[0018](4)将链霉亲和素喷涂于硝酸纤维膜上作为lt和sth目标基因检测线，将抗地高辛抗体喷涂于硝酸纤维膜上作为uidA目标基因检测线，制备检测试纸条；
[0019](5)将步骤(2)得到的不对称聚合酶链式反应产物与步骤(3)制备的检测探针混匀，之后利用步骤(4)制备的检测试纸条进行检测。
[0020]本专利技术的检测原理为：本专利技术首先利用多重不对称聚合酶链式反应技术制备连接标记物的uidA、lt和sth目标单链DNA；再制备标记可识别uidA、lt和sth目标单链DNA的检测探针，检测探针包括带颜色的微球和可以与uidA、lt和sth目标单链DNA特异性结合的单链DNA；将检测探针与不对称聚合酶链式反应产物混合孵育，则连接了标记物的不对称聚合酶链式反应产物(uidA、lt和sth单链DNA)可与带颜色的微球形成复合物。将可识别标记物的蛋白喷在硝酸纤维素膜上形成双检测线，再将样品垫、结合垫、NC膜、吸水纸按顺序贴于PVC底板上，切成3.9mm宽的免疫层析试纸条。利用免疫层析法对检测样品中的产肠毒素大肠埃希氏菌标志性毒力基因lt和sth进行鉴定，同时亦可鉴定大肠埃希氏菌标志性特征基因uidA(参见附图1)。当待测样品提取核酸中含有一定浓度的uidA、lt或sth基因时，多重不对称聚合酶链式反应将以此为模板扩增出相应的连接标记物的目标单链DNA，并且可与检测探针结合，该复合物在免疫层析过程中会被硝酸纤维素膜上的蛋白捕获，从而在相应的检测线显示出颜色线，以此判断样品中是否含有ETEC。
[0021]进一步的，所述步骤(2)的反应体系为：加入12.5μL PCR扩增预混液(含PCR扩增的基本原料)，一定量的引物混合液(uidA、lt和sth正向引物与反向引物终浓度比为1:3～1:6)，1.0μL可疑单菌落全基因组DNA(1ng/μL或以上)，最后用去离子水定容至25μL。
[0022]进一步的，所述步骤(2)的反应条件为：98℃变性，5～10min；98℃，10s；50～65℃，5s；72℃，30s；30～70个循环；最后72℃，延伸5min。
[0023]进一步的，步骤(2)所述标记物为生物素或地高辛。
[0024]进一步的，步骤(3)的具体操作为：
[0025](31)带颜色的微球的预处理：取1mL MES缓冲液与4μL、0.1μm带颜色的微球混合，室温超声5～10min后，加入4μL EDC溶液，室温超声5～10min后，放置混合仪上混合反应15min；
[0026](32)标记：加入4μL氨基标记的lt
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F、sth
‑
F和uidA
‑
F，25℃振荡孵育3～9h后离心，离心条件为离心温度4℃、转速5000～20000rpm、离心时间10～50min，弃上清保留沉淀；
[0027](33)封闭：向所述沉淀中加入900μL的0.01M PBS复溶；之后加入50μL的封闭剂混合反应10～50min；再加入100μL质量浓度为0.5～5％的PEG20000溶液混合反应10～50min；最后离心10～50min后弃上清，加入100μL 0.01M PBS复溶，置于4℃冰箱待用，离心条件为离心温度4℃，转速15000rpm。
[0028]进一步的，步骤(33)所述封闭剂为酪蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白、聚乙二醇、脱脂牛奶、鱼明胶或葡聚糖。
[002本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种产肠毒素大肠埃希氏菌的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)培养目标菌，提取目标菌全基因组DNA；(2)以提取的目标菌全基因组DNA为模板，进行多重不对称聚合酶链式反应，所需引物序列如下：lt
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F：5
’‑
GAACAGGAGGTTTCTGCGTTAGGTG
‑3’
；SEQ ID No.1；lt
‑
R：5
’‑
CTTTCAATGGCTTTTTTTTGGGAGTC
‑3’
；SEQ ID No.2；sth
‑
F：5
’‑
TGTCTTTTTCACCTTTCGCTC
‑3’
；SEQ ID No.3；sth
‑
R：5
’‑
CGGTACAAGCAGGATTACAACAC
‑3’
；SEQ ID No.4；uidA
‑
F：5
’‑
GCGAGGTACGGTAGGAGTTG
‑3’
；SEQ ID No.5；uidA
‑
R：5
’‑
TCACAGCCAAAAGCCAGACA
‑3’
；SEQ ID No.6；并且上述uidA下游引物(uidA
‑
R)5
’
端标记地高辛，lt和sth下游引物(lt
‑
R和sth
‑
R)5
’
端标记生物素；(3)采用带颜色的微球标记可识别uidA、lt和sth目标基因的DNA序列，获得检测探针；(4)将链霉亲和素喷涂于硝酸纤维膜上作为lt和sth目标基因检测线，将抗地高辛抗体喷涂于硝酸纤维膜上作为uidA目标基因检测线，制备检测试纸条；(5)将步骤(2)得到的不对称聚合酶链式反应产物与步骤(3)制备的检测探针混匀，之后利用步骤(4)制备的检测试纸条进行检测。2.如权利要求1所述的一种产肠毒素大肠埃希氏菌的鉴定方...
【专利技术属性】
技术研发人员：山珊，黄艳梅，刘道峰，刘成伟，
申请(专利权)人：江西师范大学，
类型：发明
国别省市：
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