一种棘孢小单孢菌工业生产菌株的接合转移方法技术

本发明专利技术公开了一种棘孢小单孢菌工业生产菌株的接合转移方法，包括下述步骤：1)将棘孢小单孢菌的孢子接种至液体培养基中进行预培养，然后对菌体分别进行收集、重悬、热激处理获得棘孢小单孢菌受体菌；2)将供体菌与步骤1)中的棘孢小单孢菌受体菌混合后共培养，共培养结束后，再涂布于另加入Mg

【技术实现步骤摘要】
一种棘孢小单孢菌工业生产菌株的接合转移方法


[0001]本专利技术涉及微生物领域，具体涉及一种棘孢小单孢菌工业生产菌株的接合转移方法。

技术介绍

[0002]放线菌是一类主要呈菌丝状生长和以孢子繁殖的原核生物，作为极其重要的微生物资源而受到广泛关注。放线菌能产生大量的次级代谢产物，目前应用的抗生素约70％是由各种放线菌所产生，在医药工业、农业等方面有重要意义。放线菌科种类繁多，包含链霉菌属、放线菌属、小单孢菌属、游动放线菌属等。采用基因工程手段改造放线菌以实现提高产量、降低或去除杂质组分、激活沉默基因表达、改造化合物结构或产生新结构化合物，从而实现放线菌工业菌株的构建，这是目前放线菌研究工作的主要目的。
[0003]庆大霉素是一种氨基糖苷类抗生素，主要用于各种细菌感染类疾病的治疗，是我国抗感染必备的基本药物。工业上主要采用棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora)作为庆大霉素的生产菌。因此，对棘孢小单孢菌进行深入研究，特别是分子遗传学方面的研究，意义重大。
[0004]接合转移是指供体和受体细胞间直接接触，质粒DNA从供体向受体转移的过程，是水平基因转移的主要方式之一，也是目前最广泛应用于放线菌的基因转移方法。接合转移步骤简单、操作方便且耗时短，已在多种链霉菌中成功应用，尤其是在模式菌种中，操作流程已相当成熟。相较于链霉菌，其他的稀有放线菌例小单孢菌由于缺乏通用的遗传操作系统导致遗传操作困难从而限制了进一步的研究，尤其对于工业生产菌株而言，菌株背景的复杂性导致存在许多不可预知的因素，接合转移的效率普遍较低。专利CN201610158588.2中采用TSB液体培养基来萌发红色糖多孢菌工业生产菌株的孢子进行接合转移，效率最高仅为2
×
10
‑5。总体上与小单孢菌遗传操作方法有关的文献较少，对于棘孢小单孢菌工业菌株，采用传统的孢子热激法进行接合转移(《Practical Streptomyces Genetics》2000)基本得不到转化子。为此，有必要继续优化接合转移的方法，进一步提高接合转移效率，建立一套合适高效的遗传操作体系。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种棘孢小单孢菌工业生产菌株接合转移方法，该方法操作简单，周期短，接合转移效率高。
[0006]本专利技术提供了一种棘孢小单孢菌工业生产菌株的接合转移方法，包括以下步骤：
[0007]1)将棘孢小单孢菌的孢子接种至液体培养基中进行预培养，然后对菌体分别进行收集、重悬、热激处理获得棘孢小单孢菌受体菌；
[0008]2)将供体菌与步骤1)中的棘孢小单孢菌受体菌混合后共培养，共培养结束后，再涂布于另加入Mg
2+
的固体培养基中培养即可生长出接合转移子；
[0009]其中，所述步骤1)中液体培养基包含：碳源1.5～2.3％，氮源0.48～0.77％和无机
盐0.06～0.1％，所述碳源选自可溶性淀粉、葡萄糖或甘油中的任一种或多种，优选为可溶性淀粉、葡萄糖、甘油的组合，所述氮源选自酵母抽提物、胰蛋白胨或KNO3中的任一种或多种，优选为酵母抽提物、胰蛋白胨、KNO3的组合，所述无机盐为K2HPO4·
3H2O、MgSO4·
7H2O、FeSO4·
7H2O、ZnSO4·
7H2O、CoCl2·
6H2O的组合；
[0010]所述步骤2)中的固体培养基选自ISP4固体培养基、改良的2CM固体培养基或2CM固体培养基，优选为ISP4固体培养基或改良的2CM固体培养基。
[0011]在具体的实施方案中，所述步骤1)中液体培养基包含：酵母抽提物0.3～0.5％，葡萄糖0.3～0.5％，可溶性淀粉0.8～1.2％，胰蛋白胨0.15～0.22％，甘油0.4～0.6％，KNO
3 0.03～0.05％，K2HPO4·
3H2O 0.03～0.05％，MgSO4·
7H2O 0.03～0.04％，FeSO4·
7H2O 0.002～0.003％，ZnSO4·
7H2O0.0008～0.0012％，CoCl2·
6H2O 0.0004～0.0005％，pH 7.0～7.2。
[0012]在具体的实施方案中，所述步骤2)中的改良的2CM固体培养基包含：可溶性淀粉0.8
‑
1.2％，胰蛋白胨0.18～0.22％，氯化钠0.08～0.12％，硫酸铵0.18～0.22％，K2HPO4·
3H2O 0.08～0.12％，MgSO4·
7H2O 0.18～0.22％，CaCO
3 0.18～0.22％，酪蛋白氨基酸0.18～0.22％，FeSO4·
7H2O0.00008～0.00012％，MnCl2·
4H2O 0.00008～0.00012％，ZnSO4·
7H2O 0.00008～0.00012％，琼脂1.8～2.2％，pH 7.0～7.2。
[0013]在具体的实施方案中，所述步骤2)中的供体菌与步骤1)中的棘孢小单孢菌受体菌的细胞数量比为15:1
‑
1:3，优选为7:1～1:1，最优选3.5:1。
[0014]在具体的实施方案中，Mg
2+
的浓度为20～50mM，优选为30～40mM，最优选40mM。
[0015]在具体的实施方案中，Mg
2+
是以MgCl2或MgSO4的形式添加到固体培养基中，优选为Mg
2+
是以MgCl2的形式添加到固体培养基中。
[0016]在具体的实施方案中，所述步骤2)中的供体菌为含pSET152穿梭整合型质粒的大肠杆菌ET12567(pUZ8002)。
[0017]在具体的实施方案中，所述步骤1)中的预培养为将棘孢小单孢菌培养至对数生长中期，优选的，是在35～37℃下转速为200～250r/min的摇床上培养28～32h，转速优选220r/min；所述步骤1)中重悬是在2
×
YT培养基中进行；所述步骤1)中热激处理是在50℃下热激10分钟。
[0018]在具体的实施方案中，所述步骤2)中的供体菌是经过培养，离心收集，LB漂洗和悬浮处理后的菌株。
[0019]在具体的实施方案中，所述步骤2)中的共培养是在转速为80～100r/min的摇床上培养0.5～1h；所述步骤2)中的培养是先在35～37℃培养18～20h，然后用甲氧苄啶与安普霉素覆盖，再继续于35～37℃下培养5～6天。
[0020]本专利技术的另一目的还在于提供一种接合转移用的液体培养基，包含：碳源1.5～2.3％，氮源0.48～0.77％和无机盐0.06～0.1％，所述碳源选自可溶性淀粉、葡萄糖或甘油中的任一种或多种，优选为可溶性淀粉、葡萄糖、甘油的组合，所述氮源选自酵母抽提物、胰蛋白胨或KNO3中的任一种或多种，优选为酵母抽提物、胰蛋白胨、KNO3的组合，所述无机盐为K本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种棘孢小单孢菌工业生产菌株的接合转移方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将棘孢小单孢菌的孢子接种至液体培养基中进行预培养，然后对菌体分别进行收集、重悬、热激处理获得棘孢小单孢菌受体菌；2)将供体菌与步骤1)中的棘孢小单孢菌受体菌混合后共培养，共培养结束后，再涂布于另加入Mg
2+
的固体培养基中培养即可生长出接合转移子；其中，所述步骤1)中的液体培养基包含：碳源1.5～2.3％，氮源0.48～0.77％和无机盐0.06～0.1％，所述碳源选自可溶性淀粉、葡萄糖或甘油中的任一种或多种，优选为可溶性淀粉、葡萄糖、甘油的组合，所述氮源选自酵母抽提物、胰蛋白胨或KNO3中的任一种或多种，优选为酵母抽提物、胰蛋白胨、KNO3的组合，所述无机盐为K2HPO4·
3H2O、MgSO4·
7H2O、FeSO4·
7H2O、ZnSO4·
7H2O、CoCl2·
6H2O的组合；所述步骤2)中的固体培养基选自ISP4固体培养基、改良的2CM固体培养基或2CM固体培养基，优选为ISP4固体培养基或改良的2CM固体培养基。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中液体培养基包含：酵母抽提物0.3～0.5％，葡萄糖0.3～0.5％，可溶性淀粉0.8～1.2％，胰蛋白胨0.15～0.22％，甘油0.4～0.6％，KNO
3 0.03～0.05％，K2HPO4·
3H2O 0.03～0.05％，MgSO4·
7H2O 0.03～0.04％，FeSO4·
7H2O0.002～0.003％，ZnSO4·
7H2O 0.0008～0.0012％，CoCl2·
6H2O 0.0004～0.0005％，pH 7.0～7.2。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中的改良的2CM固体培养基包含：可溶性淀粉0.8
‑
1.2％，胰蛋白胨0.18～0.22％，氯化钠0.08～0.12％，硫酸铵0.18～0.22％，K2HPO4·
3H2O 0.08～0.12％，MgSO4·
7H2O 0.18～0.22％，CaCO
3 0.18～0.22％，酪蛋白氨基酸0.18～0.22％，FeSO4·
7H2O 0.00008～0.00012％，MnCl2·
4H2O 0.00008～0.00012％，ZnSO4·
7H2O0.00008～0.00012％，琼脂1.8～2.2％，pH 7.0～7.2。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中的供体菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：余贞，庞天鹏，杨小虎，金玲月，应灵萍，
申请(专利权)人：浙江海正药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：