基于微型RNA引导核酸酶TnpB的基因编辑载体系统及其构建方法和应用技术方案

本发明专利技术属于基因组学及基因工程和生物技术领域，具体涉及基于微型RNA引导核酸酶TnpB的基因编辑载体系统及其构建方法和应用。本发明专利技术中基于TnpB的基因编辑系统只需要构建一个含tnpB基因及其3

【技术实现步骤摘要】
基于微型RNA引导核酸酶TnpB的基因编辑载体系统及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于基因组学及基因工程和生物
，具体涉及基于微型RNA引导核酸酶TnpB的基因编辑载体系统及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]以CRISRP
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Cas系统编码的可编程RNA引导核酸酶为代表的核酸酶(Cas9以及Cas12等)在微生物基因组编辑中的应用极大加速了微生物合成生物学等领域的发展(Yao et al.,2018)。然而当前可以的CRSPR核酸酶在微生物基因组编辑中的应用依然存在以下局限性和挑战。(a)目前常用的单亚基核酸酶Cas9和Cas12普遍存在蛋白尺寸大以及Cas9蛋白表达毒性的问题。(b)Cas9和Cas12会对未成功编辑的细胞产生持续靶向切割，从而极大减少了转化子数目。(c)Cas9和Cas12在单碱基编辑中的局限性。(d)CRISPR系统引导RNA与蛋白编码序列需要独立表达，这增加了遗传操作的难度。(e)当前多数开发的CRISPR
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Cas系统仅能在常温微生物中应用，能够适用于高温微生物的系统亟待开发。鉴于以上问题，亟待新型可编程核酸酶的开发与应用。
[0004]2021年，Science和Nature杂志同时报导了细菌IS200/605转座子编码的转座相关蛋白TnpB为一种新型的可编程RNA引导核酸酶(Karvelis et al.,2021；Altae et al.,2021)。这种蛋白能够特异性识别并切割双链DNA，然而其蛋白大小仅为400个氨基酸左右，比常用Cas9和Cas12核酸酶大小小一倍以上，代表了一类新型的微型可编程核酸酶。另外与CRISPR系统不同的是：TnpB的引导RNA由其自身基因以及其基因3
’
端紧邻的非编码区域编码，这表明TnpB系统的RNA组分的构建与表达将更加容易。目前耐辐射奇球菌的TnpB蛋白在哺乳动物细胞系中能够引起小片段DNA的插入与缺失，揭示了TnpB蛋白在基因组编辑中的潜力(Karvelis et al.,2021)。然而TnpB系统是否能够在普遍缺失非同源末端连接修复途径的微生物中进行基因编辑尚未得到研究。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足，本专利技术提供基于微型RNA引导核酸酶TnpB的基因编辑载体系统及其构建方法和应用。具体的，本专利技术通过对冰岛硫化叶菌Rey15A中TnpB蛋白的研究提出了TnpB在源宿主高保真基因组编辑中的应用，并提供了TnpB系统的构建方法及基因编辑流程。本专利技术中的TnpB编辑系统只需要构建一个含有TnpB蛋白、3
’
端非编码区域和16nt的引导序列、以及供体DNA片段的质粒。极大简化了编辑载体的构建。利用质粒编码的TnpB和引导RNA自发形成的效应复合物对基因组靶向位点进行切割，通过质粒上的供体DNA模板为细胞内的同源重组修复过程提供模板，从而实现靶向位点的精确编辑。更为重要的是，该
TnpB编辑系统能够用于微生物单碱基基因组编辑，因此具有良好的实际应用之价值。
[0006]为实现上述技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0007]本专利技术的第一个方面，提供一种基于微型RNA引导核酸酶TnpB的基因编辑载体系统，所述基因编辑载体系统包含编辑质粒，所述编辑质粒至少含有TnpB编码基因序列、3
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端非编码区和引导序列、以及供体DNA片段；
[0008]其中，所述引导序列为靶向位点对应序列克隆至TnpB编码基因3
’
端非编码区保守序列之后获得；所述引导序列长度为13
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24nt；
[0009]由于TnpB蛋白切割双链DNA时需要靶向位点5
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端存在TTGAT序列(或者TTTAA序列)，因此所述靶向位点需要位于基因组TTGAT/TTTAA序列紧邻的下游区域，所述靶向位点长度为13
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24bp。
[0010]所述供体DNA片段用于提供细胞修复TnpB产生的靶位点DNA断裂的模板；在本专利技术的一个具体实施方式中，当基因编辑具体为基因敲除时，所述供体DNA片段包括拟敲除DNA片段上下游两侧各500bp左右的侧翼DNA序列；当基因编辑具体为单碱基编辑时，所述供体DNA为含有拟突变位点的DNA片段，其突变位点应位于引导序列
‑
靶向序列配对区的前13个位点的任一位置。
[0011]本专利技术的第二个方面，提供上述基于微型RNA引导核酸酶TnpB的基因编辑载体系统的构建方法，所述构建方法包括；
[0012]S1、基因组上靶向位点的选择；
[0013]S2、靶向位点对应序列克隆至tnpB基因3
’
端保守序列之后形成引导序列；
[0014]S3、将步骤S2获得的融合片段克隆至表达载体上获得重组表达载体；
[0015]S4、克隆供体DNA片段至所述步骤S3获得的重组表达载体上即得。
[0016]需要说明的是，上述技术方案虽然以冰岛硫化叶菌Rey15A TnpB基因为例，介绍了微型RNA引导核酸酶TnpB的基因编辑载体系统及其构建方法，但显然只要在任意编码TnpB系统的原核生物中，均可实现，因此本专利技术的第三个方面，提供上述基于微型RNA引导核酸酶TnpB的基因编辑载体系统在原核生物基因组编辑中的应用。
[0017]本专利技术的第四个方面，提供一种原核生物基因组编辑的方法，所述方法包括：将上述基于微型RNA引导核酸酶TnpB的基因编辑载体系统转化至待进行基因组编辑的原核生物中，获得转化子，进而成功获得进行基因组编辑的原核生物。
[0018]其中，所述待进行基因组编辑的原核生物可以为任意编码TnpB系统的原核生物，包括细菌和古菌。例如：冰岛硫化叶菌(优选冰岛硫化叶菌Sulfolobus islandicus REY15A)，耐辐射奇球菌Deinococcus radiodurans，幽门螺杆菌Helicobacter pylori，牙周梭杆菌Fusobacterium periodonticum，嗜碱芽孢杆菌Bacillus alcalophilus，艰难梭菌Clostridioides difficile，沼泽毛球菌Trichococcus palustris，耐盐海洋丝状菌Marininema mesophilum等。
[0019]所述基因组编辑包括但不限于基因敲除、DNA片段插入、点突变中的任意一种或多种，同时由于上述系统具有高保真度，因此能够用于单碱基编辑。
[0020]与现有技术相比，上述一个或多个技术方案存在如下有益技术效果：
[0021]上述技术方案提供的基于微型RNA引导核酸酶TnpB的基因编辑载体系统转化效率高，能得到更多的转化子菌落；同时上述系统编辑载体构建本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于微型RNA引导核酸酶TnpB的基因编辑载体系统，其特征在于，所述基因编辑载体系统包含编辑质粒，所述编辑质粒至少含有TnpB编码基因序列、3
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端非编码区和引导序列、以及供体DNA片段；其中，所述引导序列为靶向位点对应序列克隆至TnpB编码基因3
’
端非编码区保守序列之后获得；所述引导序列长度为13
‑
24nt。2.如权利要求1所述的基因编辑载体系统，其特征在于，所述靶向位点位于基因组TTGAT/TTTAA序列紧邻的下游区域，所述靶向位点长度为13
‑
24bp。3.如权利要求1所述的基因编辑载体系统，其特征在于，所述供体DNA片段用于提供细胞修复TnpB产生的靶位点DNA断裂的模板；进一步的，当基因编辑具体为基因敲除时，所述供体DNA片段包括拟敲除DNA片段上下游两侧各500bp左右的侧翼DNA序列；当基因编辑具体为单碱基编辑时，所述供体DNA为含有拟突变位点的DNA片段，其突变位点应位于引导序列
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靶向序列配对区的前13个位点的任一位置。4.权利要求1
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3任一项所述基于微型RNA引导核酸酶TnpB的基因编辑载体系统的构建方法，所述构建方法包括；S1、基因组上靶向位点的选择；S2、靶向位点对应序列克隆至tnpB基因3
’
端保守序列之后形成引导序列；S3、将步骤S2获得的融合片段克隆至表达载体上获得重组表达载体；S4、克隆供体DNA片段至所述步骤S3获得的重组表达载体上即得。5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述靶向位点位于基因组TTGAT/TTTAA序列紧邻的下游区域，所述靶向位点长度为13
‑
24bp。6.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S2中，将引导序列加到引物上，然后直接与tnpB基因引物一步扩增出含有tnpB基因、3
’
端非编码区保守序列以及引导序列的DNA片段即融合...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯旭，佘群新，许如意，廖江兰，赵鹏鹏，于振霄，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：