百日咳抗原重组表达载体及其工程菌和应用制造技术

本发明专利技术提供了百日咳抗原重组表达载体及其工程菌和应用，所述百日咳抗原重组表达载体包含百日咳黏附素蛋白表达框、抗性筛选基因、丝状血凝素基因上游重组核酸片段和下游重组核酸片段，其中所述百日咳黏附素蛋白表达框位于所述丝状血凝素基因上游重组核酸片段和下游核酸重组片段之间，且所述丝状血凝素基因上游重组核酸片段和下游重组核酸片段能够分别与丝状血凝素基因的上游和下游进行同源重组。所述重组表达载体中的FHA蛋白基因被敲除并增加了PRN蛋白基因拷贝，使得所述百日咳杆菌基因工程菌能够高效地过表达PRN蛋白抗原以及PT蛋白，而且表达的PRN蛋白抗原和PT蛋白分别存在于菌体和上清中，有利于后续的抗原分离纯化。化。

【技术实现步骤摘要】
百日咳抗原重组表达载体及其工程菌和应用


[0001]本专利技术属于生物制药领域，涉及一种百日咳抗原重组表达载体及其工程菌和应用。具体地，本专利技术涉及一种过表达百日咳黏附素抗原，同时表达百日咳毒素抗原的重组表达载体以及包含它的工程菌和两者在制备百日咳黏附素和百日咳毒素抗原中的应用。

技术介绍

[0002]百日咳(whooping cough)是由百日咳杆菌(Bordetella pertussis)引起的一种烈性呼吸道传染病，对婴幼儿危害极大。临床特征为咳嗽逐渐加重，呈典型的阵发性、痉挛性咳嗽，咳嗽终末出现深长的鸡啼样吸气性吼声，病程长达2～3个月，故有百日咳之称。
[0003]目前针对百日咳的预防主要采用注射疫苗，初代全细胞百日咳疫苗(whole cell pertussis vaccine，wPV)使该疾病得到了良好的控制，但因接种会引起较高的不良反应，逐渐被更安全的无细胞百日咳疫苗(acellular pertussis vaccine，aPV)取代。但自2010年以来，成人和青少年百日咳发病率又有所上升，分析原因主要是因为aPV效力快速下降、疫苗选择压力下的菌株变异等。因此，对百日咳疫苗的持续改进是应对百日咳传播的有效方法。
[0004]百日咳杆菌在生长过程中会产生百日咳毒素(Pertussis Toxin，PT)、丝状血凝素(Filamentous Haemagglutinin，FHA)、百日咳黏附素(Pertactin，PRN)和脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)等多种抗原。国内上市的国产aPV都是利用共纯化的方法纯化出百日咳抗原溶液，经脱毒剂处理后吸附铝佐剂而成。由于没有对百日咳的不同抗原成分单独进行分离，不同生产批次的百日咳抗原液中各种抗原的比例差异较大，影响了疫苗质量的稳定性。
[0005]进口的aPV是利用技术更先进的柱层析法，将PT和FHA等抗原单独提取出来分别脱毒，再将这些抗原组分按一定的比例混合制成疫苗。该工艺保证了疫苗的批间质量一致，而且抗原纯度为90％～95％，适合于开发以DTacP为基础的联合疫苗(胡业勤等，组分无细胞百日咳疫苗纯化新工艺的建立)。例如，中国专利CN102793915B提供了三种组分的百日咳疫苗组合物，即分别纯化以获得PT、PRN和FHA，再将其按照一定比例混合。资料显示，FHA抗原易降解，为纯化效果的判定带来干扰。多篇文献(如吴腾捷，张斌，张青等，无细胞百日咳疫苗纯化新工艺的建立[J]，中国生物制品学杂志，26(01)：5
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8)都曾报道将FHA蛋白与PT蛋白分离的纯化方法，而单独提取PT蛋白的步骤复杂。
[0006]上述方法都存在着抗原蛋白表达量少、分离纯化繁琐的问题。因此，亟需开发一种能够高效表达抗原组分，且分离纯化程序简化的百日咳抗原制备方法。

技术实现思路

[0007]为了更简便地获得单独组分的PRN蛋白及PT蛋白，本专利技术人通过构建一种百日咳抗原重组表达载体对百日咳抗原生产菌株进行了改进，从而提供了一种FHA蛋白表达被阻断的重组工程菌。该菌株可同时表达PRN蛋白和PT蛋白，且发酵时间短，产生的这两种蛋白
含量也显著高于野生菌株，便于分离纯化。
[0008]一方面，本专利技术提供了一种百日咳抗原重组表达载体，其包含百日咳黏附素蛋白表达框、抗性筛选基因、丝状血凝素基因上游重组核酸片段和下游重组核酸片段，其中所述百日咳黏附素蛋白表达框位于所述丝状血凝素基因上游重组核酸片段和下游重组核酸片段之间，且所述丝状血凝素基因上游重组核酸片段和下游重组核酸片段能够分别与丝状血凝素基因的上游和下游进行同源重组。其中，所述丝状血凝素基因如SEQ ID NO：1所示。
[0009]根据本专利技术的表达载体可以为质粒pUC57、pEASY
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Blunt克隆载体或pBBR系列载体，优选为质粒pUC57。
[0010]根据本专利技术的丝状血凝素基因上游重组核酸片段可以包含或为SEQ ID NO：2所示核苷酸序列中第m
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1000位连续碱基组成的核酸片段，其中m为≤57的自然数。优选地，所述丝状血凝素基因上游重组核酸片段为SEQ ID NO：2所示核苷序列中第57
‑
1000位连续碱基组成的核酸片段。
[0011]根据本专利技术的一个实施方案，所述百日咳黏附素表达框的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
[0012]根据本专利技术的丝状血凝素基因下游重组核酸片段可以包含或为SEQ ID NO.4所示核苷序列中第1
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n位连续碱基组成的核酸片段，其中n为≥798
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1000的自然数。优选地，所述丝状血凝素基因下游重组核酸片段为SEQ ID NO：4所示核苷序列中第1
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798位连续碱基组成的核酸片段。
[0013]根据本专利技术的抗性筛选基因可以选自卡那霉素抗性筛选基因、四环素抗性筛选基因、氨苄青霉素抗性筛选基因或氯霉素抗性筛选基因中的一种或多种，优选为卡那霉素抗性筛选基因。具体地，所述卡那霉素抗性筛选基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示(Cloning vector pSN
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caSAT1，genebank:MT001914.1)；所述四环素抗性筛选基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示(Cloning vector pJC24，Genebank:KC442291.1)；所述氨苄青霉素抗性筛选基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示(Cloning vector pcDNA3
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WSN
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PB2，Genebank:MT966986.1)；所述氯霉素抗性筛选基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示(Cloning vector pMYC，Genebank:MT572316.1)。
[0014]另一方面，本专利技术还提供了一种百日咳抗原重组表达工程菌，其包含根据本专利技术的重组表达载体。
[0015]再一方面，本专利技术还提供了一种根据本专利技术的百日咳抗原重组表达工程菌的制备方法，其包括采用根据本专利技术的重组表达载体转化野生型百日咳杆菌感受态细胞。
[0016]根据本专利技术的另一个实施方案，所述野生型百日咳杆菌为野生型百日咳杆菌菌株ATCC
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BAA
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589。
[0017]根据本专利技术的另一个实施方案，所述转化为电转化。具体地，所述电转化可以包括将所述重组表达载体线性化，在2500V和5ms的条件下电转化野生型百日咳杆菌感受态细胞。
[0018]根据本专利技术的另一个实施方案，所述制备方法还包括利用所述抗性筛选基因筛选经转化的野生型百日咳杆菌感受态细胞。
[0019]又一方面，本专利技术还提供了一种百日咳抗原的制备方法，其包括采用根据本专利技术的百日咳抗原重组表达工程菌进行发酵。
[0020]根据本专利技术的另一个实施方案，所述发酵包括以下步骤：
[0021](1)将根本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种百日咳抗原重组表达载体，其包含百日咳黏附素蛋白表达框、抗性筛选基因、丝状血凝素基因上游重组核酸片段和下游重组核酸片段，其中所述百日咳黏附素蛋白表达框位于所述丝状血凝素基因上游重组核酸片段和下游重组核酸片段之间，且所述丝状血凝素基因上游重组核酸片段和下游重组核酸片段能够分别与丝状血凝素基因的上游和下游进行同源重组。2.根据权利要求1所述的重组表达载体，其中，所述表达载体为质粒pUC57、pEASY
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Blunt克隆载体或pBBR系列载体，优选为质粒pUC57。3.根据权利要求1或2所述的重组表达载体，其中，所述丝状血凝素基因上游重组核酸片段包含或为SEQ ID NO：2所示核苷酸序列中第m
‑
1000位连续碱基组成的核酸片段，其中m为≤57的自然数；优选地，所述丝状血凝素基因上游重组核酸片段为SEQ ID NO：2所示核苷序列中第57
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1000位连续碱基组成的核酸片段；优选地，所述丝状血凝素基因下游重组核酸片段包含或为SEQ ID NO：4所示核苷酸序列中第1
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n位连续碱基组成的核酸片段，其中n为≥798
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1000的自然数；更优选地，所述丝状血凝素基因下游重组核酸片段为SEQ ID NO：4所示核苷酸序列中第1
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798位连续碱基组成的核酸片段。4.根据权利要求1至3中任一项所述的重组表达载体，其中，所述百日咳黏附素表达框的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。5.根据权利要求1至4中任一项所述的重组表达载体，其中，所述抗性筛选基因选自卡那霉素抗性筛选基因、四环素抗性筛选基因、氨苄青霉素抗性筛选基因或氯霉素抗性筛选基因中的一种或多种，优选为卡那霉素抗性筛选基因；...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛君，李建强，李玲，张大燕，王玺，石应辉，任苏林，周童，
申请(专利权)人：远大赛威信生命科学南京有限公司，
类型：发明
国别省市：