一种多糖-载体蛋白缀合物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物制药领域，具体涉及一种多糖

【技术实现步骤摘要】
一种多糖
‑
载体蛋白缀合物及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物制药领域，具体提供一种多糖
‑
载体蛋白缀合物及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]破伤风毒素是由破伤风杆菌(Clostridium tetani)产生的一种分子量约150kD的蛋白质，是一种神经毒素。破伤风毒素全长1315个氨基酸，由A、B、C三部分组成，每部分分子量均约为50kDa。其中，重链的C端为破伤风毒素C片段(tetanus toxin fragment C，TTc)，具有结合神经细胞的作用。
[0003]研究发现，传统破伤风类毒素通过甲醛脱毒制备，存在毒性逆转的可能，与之相比，TTc被证实具有完整的破伤风毒素结合神经节苷脂的能力，且不具备神经毒活性，具有制备为载体蛋白的潜在优势(Qazi O,Bolgiano B,Crane D,et al.J Mol Biol,2007,365(1):123
‑
134.)。由此制备的多糖
‑
载体蛋白缀合物，即是由多糖共价吸附在载体蛋白上构成。
[0004]目前，制备多糖
‑
载体蛋白缀合物首先要对纯化后的多糖进行化学修饰，以产生可与载体蛋白连接的反应基团。活化多糖常用的两种方法分别为邻羟基的高碘酸盐氧化和羟基的氰化，通常，活化多糖的结合率要低于20％(Frasch C E.Vaccine,2009,27(46):6468
‑
6470.)。此外，现有文献也提及了TTc作为载体蛋白的用途，例如WO2005000346A1、CN200680023149.5等，但就TTc与多糖结合后的具体效果，并未有太多研究。因此，筛选一类多糖结合率高，且具有药效优势的TTc载体蛋白，是本领域亟待解决的问题。

技术实现思路

[0005]基于上述研究，专利技术人构建了一种重组TTc蛋白，截取氨基酸突变的破伤风毒素的C片段，并进行了密码子优化。应用所述重组TTc蛋白产生的多糖
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载体蛋白缀合物产率较高，同时显著提高了小鼠的免疫应答水平，免疫效果优于破伤风毒素载体缀合物。
[0006]本专利技术的一个目的是提供一种产率较高，同时具有较高的免疫应答水平的多糖
‑
载体蛋白缀合物。在所述的多糖
‑
载体蛋白缀合物中，载体蛋白为重组破伤风毒素C片段(TTc)，本专利技术的多糖
‑
载体蛋白缀合物的免疫效果优于破伤风毒素载体缀合物，可用于预防其所含多糖，例如荚膜多糖对应的细菌引起的感染性疾病，尤其可用于预防b型流感嗜血杆菌(Hib)引起的感染性疾病。
[0007]本专利技术的另一个目的是提供上述多糖
‑
载体蛋白缀合物的制备方法及其具体应用。
[0008]本专利技术的又一个目的是提供所述重组破伤风毒素C片段(TTc)的应用。
[0009]为了实现上述目的，本专利技术提供一种多糖
‑
载体蛋白缀合物，其中，载体蛋白为重组破伤风毒素C片段，序列如SEQ ID No.1所示，该片段截取自氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的破伤风毒素第865位
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第1315位的连续氨基酸片段，其中，第869位氨基酸由半胱氨酸突
变为丙氨酸。
[0010]对上述编码SEQ ID No.1的核苷酸序列进行密码子优化，获得编码所述重组破伤风毒素C片段氨基酸序列的核苷酸序列SEQ ID No.2。
[0011]在本专利技术提供的多糖
‑
载体蛋白缀合物中，多糖可以为荚膜多糖，优选选自肺炎链球菌荚膜多糖、脑炎奈瑟氏球菌荚膜多糖、b型流感嗜血杆菌(Hib)荚膜多糖；优选地，所述多糖为Hib荚膜多糖。
[0012]Hib荚膜多糖与载体蛋白的投料质量比可以为1:1
‑
1.5，优选为1:1.2
‑
1.3。
[0013]优选地，在所述多糖
‑
载体蛋白缀合物中，所述多糖的羟基与所述载体蛋白的羧基通过连接臂
[0014]共价连接形成包括以下结构的多糖
‑
载体蛋白缀合物
[0015]本专利技术还提供上述多糖
‑
载体蛋白缀合物的制备方法，所述方法包括如下步骤：
①
构建氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的重组破伤风毒素C片段作为载体蛋白；
[0016]②
制备多糖并进行纯化；
[0017]③
将纯化后的多糖与载体蛋白进行缀合。
[0018]在优选的实施方案中，所述多糖为Hib荚膜多糖；优选地，所述Hib荚膜多糖与载体蛋白的投料质量比为1:1
‑
1.5，更优选为1:1.2
‑
1.3。
[0019]进一步优选地，所述步骤
②
为使用b型流感嗜血杆菌菌种制备Hib荚膜多糖并进行纯化。
[0020]在优选的实施方案中，所述步骤
③
所述的缀合是通过包括以下步骤的方法进行的：制备活化的多糖衍生物，然后在缩合剂的作用下，实现所述多糖与载体蛋白的共价键结合。
[0021]优选地，所述步骤
③
所述的缀合是通过包括以下步骤的方法进行的：首先用N
‑
氰
‑4‑
二甲氨基
‑
吡啶四氟硼酸盐活化所述多糖的羟基，然后与1,6
‑
己二酰肼反应形成多糖衍生物，最后在缩合剂的作用下，将所述多糖衍生物与所述重组破伤风毒素C片段结合形成所述多糖
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载体蛋白缀合物。
[0022]更优选地，所述缩合剂为碳二亚胺。
[0023]在具体实施方案中，所述b型流感嗜血杆菌菌种优选为Haemophilus influenzae Type b，保藏编号为CMCC 5853，购自中国医学细菌保藏管理中心。
[0024]本专利技术还提供上述多糖
‑
载体蛋白缀合物在制备免疫制剂中的应用。
[0025]在具体的实施方案中，所述免疫制剂为疫苗。
[0026]本专利技术还提供氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的重组破伤风毒素C片段作为载体蛋白在构建多糖
‑
载体蛋白缀合物中的应用。其中，所述多糖优选为荚膜多糖，更优选为Hib荚膜多糖。
[0027]本专利技术多糖
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载体蛋白缀合物还可包含另外的添加剂，如药物载体或添加剂，尤其
是当它以免疫制剂的形式存在时。
[0028]优选的药物载体尤其是水，缓冲水溶液，优选等渗盐溶液如PBS(磷酸盐缓冲液)、葡萄糖、甘露醇、右旋葡萄糖、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸镁、0.3％甘油、透明质酸、乙醇或聚亚烷基二醇如聚丙二醇、甘油三酯等。
[0029]上述多糖
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载体蛋白缀合物可包含润湿剂、乳化剂或缓冲液物质作为添加剂。
[0030]上本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多糖
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载体蛋白缀合物，其特征在于，所述载体蛋白为氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的重组破伤风毒素C片段。2.如权利要求1所述的多糖
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载体蛋白缀合物，其特征在于，编码所述重组破伤风毒素C片段氨基酸序列的核苷酸序列为SEQ ID No.2。3.如权利要求1
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2任一项所述的多糖
‑
载体蛋白缀合物，其特征在于，所述多糖为荚膜多糖，优选选自肺炎链球菌荚膜多糖、脑炎奈瑟氏球菌荚膜多糖、b型流感嗜血杆菌(Hib)荚膜多糖。4.如权利要求3所述的多糖
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载体蛋白缀合物，其特征在于，所述多糖为Hib荚膜多糖。5.如权利要求4所述的多糖
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载体蛋白缀合物，其特征在于，所述Hib荚膜多糖与载体蛋白的投料质量比为1:1
‑
1.5；优选地，所述Hib荚膜多糖与载体蛋白的投料质量比为1:1.2
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1.3。6.如权利要求5所述的多糖
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载体蛋白缀合物，其特征在于，在所述多糖
‑
载体蛋白缀合物中，所述多糖的羟基与所述载体蛋白的羧基通过连接臂共价连接形成包括以下结构的多糖
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载体蛋白缀合物7.一种如权利要求1
‑
6任一项所述多糖
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载体蛋白缀合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
①
构建氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的重组破伤风毒素C片段作为载体蛋白；
②
制备多糖并进行纯化；
③
将纯化后的多糖与载体蛋白进行缀合。8.如权利要求7所述的制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：李建强，王玺，葛君，石应辉，周童，王晓东，方侃，王瑶，张胜兰，吉枝丹，
申请(专利权)人：远大赛威信生命科学南京有限公司，
类型：发明
国别省市：