产气荚膜梭菌溶血素O在制备激活NLRP3炎症小体的特异性激活剂中的应用制造技术

本发明专利技术提供了产气荚膜梭菌溶血素O在制备激活NLRP3炎症小体的特异性激活剂中的应用，属于生物医药技术领域。PFO是一种NLRP3炎症小体特异性激活剂，通过与细胞膜上的胆固醇结合进入胞内，影响细胞内线粒体与溶酶体的结构功能等，从而激活NLRP3炎症小体。本发明专利技术为深入了解PFO特异性激活NLRP3炎症小体的机理，以及未来在靶向治疗PFO毒素感染的医药研究中提供新思路。思路。思路。

【技术实现步骤摘要】
产气荚膜梭菌溶血素O在制备激活NLRP3炎症小体的特异性激活剂中的应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，特别是涉及产气荚膜梭菌溶血素O在制备激活NLRP3炎症小体的特异性激活剂中的应用。

技术介绍

[0002]炎症小体是一种多蛋白免疫复合物，能够识别病原相关分子模式(PAMPs)和宿主产生的危险信号分子(DAMPs)，从而激活下游前体细胞因子，使机体产生相应的免疫反应。其中属于NLR蛋白家族的NLRP3炎症小体是最常见的炎症小体之一，NLRP3蛋白作为受体蛋白(receptor)可以感应包括病原体、毒力因子(尼日利亚菌素)、核酸、ATP、无机颗粒(二氧化硅和石棉)、微结晶体(胆固醇结晶和尿酸钠结晶)在内的多种刺激信号，在天然免疫中发挥着十分重要的作用。许多慢性炎症疾病，例如二型糖尿病，粥样动脉硬化和肿瘤等都与NLRP3炎症小体的激活紧密相连。
[0003]产气荚膜梭菌是一种人类气性坏疽的主要病原菌，可导致细胞坏死或组织水肿等病症。前期研究表明，产气荚膜梭菌能够产生并分泌20余种复杂的外毒素，这些毒素通常需要与宿主细胞的受体结合，激活细胞内部的信号通路从而导致细胞死亡。产气荚膜梭菌溶血素O(Perfringolysin O，PFO)是一种由产气荚膜梭菌产生的胆固醇依赖性成孔溶细胞素，属于胆固醇依赖性溶血素(CDC)家族。PFO能够在细胞膜上形成孔道，引起细胞膜电位的大幅度变化，与胞浆分子的流失，造成细胞死亡，最终导致组织坏死。虽然目前已经有不少关于PFO在临床气性坏疽疾病的报道，但仍缺乏PFO对NLRP3炎症小体激活机理的相关研究。

技术实现思路

[0004]为了解决上述问题，本专利技术提供了产气荚膜梭菌溶血素O在制备激活NLRP3炎症小体的特异性激活剂中的应用，PFO是一种NLRP3炎症小体特异性激活剂，通过与细胞膜上的胆固醇结合进入胞内，影响细胞内线粒体与溶酶体的结构功能等，从而激活NLRP3炎症小体。本专利技术为深入了解PFO特异性激活NLRP3炎症小体的机理，以及未来在靶向治疗PFO毒素感染的医药研究中提供新思路。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0006]本专利技术提供了产气荚膜梭菌溶血素O在制备激活NLRP3炎症小体的特异性激活剂中的应用。
[0007]优选的，所述产气荚膜梭菌溶血素O在体内和/或体外激活NLRP3炎症小体。
[0008]优选的，所述产气荚膜梭菌溶血素O进入细胞内激活NLRP3炎症小体。
[0009]优选的，所述产气荚膜梭菌溶血素O与细胞膜上的胆固醇结合，在细胞膜上形成孔道，进入细胞内并激活NLRP3炎症小体，导致细胞焦亡。
[0010]优选的，所述产气荚膜梭菌溶血素O侵染细胞后对线粒体和溶酶体产生影响。
[0011]优选的，所述产气荚膜梭菌溶血素O侵染细胞后破坏线粒体，使线粒体释放ROS，激
活NLRP3炎症小体。
[0012]优选的，所述产气荚膜梭菌溶血素O侵染细胞后破坏溶酶体，导致溶酶体破裂进而激活NLRP3炎症小体。
[0013]优选的，所述产气荚膜梭菌溶血素O引起细胞内K
+
的浓度变化，激活NLRP3炎症小体。
[0014]有益效果：
[0015]PFO是一种NLRP3炎症小体特异性激活剂，通过与细胞膜上的胆固醇结合进入胞内，影响细胞内线粒体与溶酶体的结构功能等，从而激活NLRP3炎症小体。本专利技术为深入了解PFO特异性激活NLRP3炎症小体的机理，以及未来在靶向治疗PFO毒素感染的医药研究中提供新思路。
附图说明
[0016]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0017]图1中A为敲除NLRP3基因的小鼠与野生型小鼠的巨噬细胞在同等条件下加入LPS+PFO处理后，caspase
‑
1与p20蛋白的表达电泳图；图1中B为分别在LPS+PFO与LPS+Nigericin诱导的巨噬细胞NLRP3炎症小体活化条件下，NLRP3炎症小体抑制剂MCC950对Caspase
‑
1、Pro
‑
IL
‑
1β、GSDMD以及其活性亚基p20、p17、p30的蛋白表达的作用；图1中C为在此条件下，定量检测的IL
‑
1β蛋白表达量；图1中D为在此条件下，检测的LDH释放；
[0018]图2为加入胆固醇抑制剂MCD或在此条件下利用转染试剂DOTAP对PFO进行转染，PFO对NLRP3炎症小体激活产生的作用；图2中A为在此条件下，检测Caspase
‑
1、Pro
‑
IL
‑
1β以及其活性亚基p20、p17蛋白的表达量图；图2中B为在此条件下，定量检测的IL
‑
1β蛋白表达量；图2中C为在此条件下，检测的LDH释放；
[0019]图3为在加入抑制巨噬细胞内吞的Cytochalasin D试剂后，PFO对NLRP3炎症小体激活产生的作用；图3中A为在此条件下，检测Caspase
‑
1、Pro
‑
IL
‑
1β以及其活性亚基p20、p17蛋白的表达量图；图3中B为在此条件下，定量检测的IL
‑
1β蛋白表达量；图3中C为在此条件下，检测的LDH释放百分比；
[0020]图4为分别用胆固醇抑制剂MCD与抑制巨噬细胞内吞的Cytochalasin D试剂处理细胞后，PFO与线粒体和溶酶体的相互作用；
[0021]图5为加入非定向ROS清除剂NAC与线粒体ROS定向清除剂Mito
‑
tempo后，PFO对胞内总ROS与线粒体ROS的激活作用；
[0022]图6为加入线粒体ROS定向清除剂Mito
‑
tempo处理细胞后，PFO对巨噬细胞NLRP3炎症小体活化的作用；图6中A为在此条件下，线粒体膜电位测量图；
[0023]图6中B为在此条件下，检测Caspase
‑
1、Pro
‑
IL
‑
1β、GSDMD以及其活性亚基p20、p17、p30的蛋白表达量；图6中C为在此条件下，定量检测的IL
‑
1β蛋白表达量；图6中D为在此条件下，检测的LDH释放量；
[0024]图7为加入溶酶稳定剂CA
‑
074、BafilomycinA、NH4Cl后，PFO对NLRP3炎症小体激活产生的作用；图7中A为由AO吖啶橙荧光强度评判的溶酶体膜破裂程度图；图7中B为在此条件下，检测Caspase
‑
1、Pro
‑
IL
‑
1β以及其活性亚基p20、p17蛋白的表达量图；图7中C为在此
条件下，定量检测的IL
‑
1β蛋白表达量；图7中D为在此条件下，检测本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.产气荚膜梭菌溶血素O在制备激活NLRP3炎症小体的特异性激活剂中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产气荚膜梭菌溶血素O在体内和/或体外激活NLRP3炎症小体。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产气荚膜梭菌溶血素O进入细胞内激活NLRP3炎症小体。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产气荚膜梭菌溶血素O与细胞膜上的胆固醇结合，在细胞膜上形成孔道，进入细胞内并激活NLRP3炎症小体，导致细胞焦亡。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛岩松，王馨懿，任颖，李亚博，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：