转录抑制因子LsrR的应用及提高植物乳杆菌环境胁迫耐受性的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高植物乳杆菌环境胁迫耐受性的方法，包括敲除转录抑制因子LsrR的步骤，通过构建转录抑制因子LsrR的敲除质粒并将其导入植物乳杆菌中，实现敲除转录抑制因子LsrR，所述环境胁迫为恶劣温度条件、酸碱条件以及胆盐条件中的一种或者几种。本发明专利技术鉴定了植物乳杆菌中的转录调控因子并阐明调控多糖合成的调控机制。将基因组数据挖掘与共沉淀共沉淀分析相结合，以确定植物乳杆菌特有的调节蛋白。使用电泳迁移率变动分析(EMSA)来评估该调节剂与启动子DNA的结合以催化多糖合成，并探讨了植物乳杆菌对胆汁盐、冻干、温度、pH和AI

【技术实现步骤摘要】
转录抑制因子LsrR的应用及提高植物乳杆菌环境胁迫耐受性的方法


[0001]本专利技术涉及转录抑制因子LsrR的应用及提高植物乳杆菌环境胁迫耐受性的方法，属于生物基因


技术介绍

[0002]乳酸菌作为益生菌在胃肠道和炎症性疾病中的益处已引起越来越多的关注。作为解决不同疾病的肠道菌群失衡问题的一种策略，可以使用益生菌调节免疫反应。在植物乳杆菌细胞中发现的几种效应分子(如脂磷壁酸、PGN和糖蛋白)直接有助于细菌和宿主之间的通讯。此外，胞外多糖和荚膜多糖可能会屏蔽其他负面效应分子以发挥益生菌作用。植物乳杆菌产生的多糖与细菌宿主中的抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、抗菌和抗病毒生物功能有关。
[0003]恶劣的环境条件会诱导荚膜多糖(CPS)和肽聚糖(PGN)的生物合成，从而提高抗逆性。将植物乳杆菌暴露于模拟胃肠液中表明，对胃酸和胆汁盐的耐受性可提高多糖合成并显着提高细菌存活率。此外，热休克、酸碱休克和高渗透压可上调与胞外多糖(EPS)合成相关的基因表达。了解植物乳杆菌中多糖的产生对于提高它们的环境耐受性非常必要，将增强它们在人类宿主中的益生菌活性。

技术实现思路

[0004]为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种提高植物乳杆菌环境胁迫耐受性的方法，所述方法包括敲除转录抑制因子LsrR的步骤，所述转录抑制因子LsrR编码氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白质。
[0005]进一步的：所述转录抑制因子LsrR的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0006]进一步的：通过构建转录抑制因子LsrR的敲除质粒并将其导入植物乳杆菌中，实现敲除转录抑制因子LsrR。
[0007]进一步的：所述环境胁迫为恶性温度条件、酸碱条件以及胆盐条件中的一种或者几种。
[0008]本专利技术还包括转录抑制因子LsrR用于提高植物乳杆菌环境胁迫耐受性的应用，通过敲除转录抑制因子LsrR提高植物乳杆菌环境胁迫耐受性，所述转录抑制因子LsrR编码氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白质。所述转录抑制因子LsrR的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0009]有益效果：本专利技术鉴定了植物乳杆菌中的转录调控因子并阐明调控多糖合成的调控机制。将基因组数据挖掘与共沉淀分析相结合，以确定植物乳杆菌特有的调节蛋白。使用电泳迁移率变动分析(EMSA)来评估该提议的调节剂与启动子DNA的结合以催化多糖合成，并探讨了植物乳杆菌对胆汁盐、冻干、温度、pH和AI
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2的反应机制。提供了一株环境胁迫耐受增强的植物乳杆菌，具体为植物乳杆菌lsrR敲除菌株，增强了植物乳杆菌对环境胁迫的
耐受。
附图说明
[0010]图1a 37℃下，5％CO 2
气氛中孵育1小时后，109CFU/孔植物乳杆菌163细胞与12孔板中Caco
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2细胞在1μM的AI
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2以及空白对照CK下的粘附实验对比图，
[0011]图1b植物乳杆菌163在1μM的AI
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2以及空白对照CK实验中于37℃下96孔聚氯乙烯板上生长24小时的生物膜形成对比图，
[0012]图1c植物乳杆菌163在1μM的AI
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2以及空白对照CK实验中外多糖含量对比图，
[0013]图1d植物乳杆菌163在1μM的AI
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2以及空白对照CK实验中荚膜多糖含量对比图，
[0014]图1e植物乳杆菌163培养物在MRS肉汤(OD 600
＝10.0
±
0.5)中在37℃下孵育24小时后的肽聚糖含量，添加1μM的AI
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2以及空白对照CK实验，
[0015]图1f在pH 7.2下的PBS中重新悬浮至108CFU/mL并在37℃下孵育5小时后收获的植物乳杆菌163细胞的自聚集实验，添加1μM的AI
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2以及空白对照CK实验，
[0016]图2a LsrR样转录调节因子的进化树，
[0017]图2b LuxR样转录调节因子的进化树，
[0018]图3a LsrR和LuxR的EMSA(浓度为0、0.5、1.0、2.0、3.0和5.0μg)与启动子P1794(100ng)在37℃下孵育30分钟凝胶图片，
[0019]图3b与过表达的LsrR(lp163
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lsrR)和LuxR(lp163
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luxR)相比，P1794 mRNA的倍数变化示意图，
[0020]图3c胞外多糖含量的变化示意图，
[0021]图3d对照菌株以及敲除LsrR(lp163
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ΔlsrR)和LuxR(lp163
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ΔluxR)菌株的荚膜多糖含量的变化，
[0022]图4a LsrR和P1794的EMSA凝胶图片，
[0023]图4b LsrR(2μg)和P1794(50ng)片段1、2和3的EMSA凝胶图片，
[0024]图4c P1794片段1、2和3的核酸序列，
[0025]图4d在三处获得的荧光信号LsrR的浓度示意图，
[0026]图5a有或没有转录调节因子Asp17、Asp16、Hsp17或LuxR下，LsrR和P1794的EMSA凝胶图片，
[0027]图5b asp17(lp163
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asp17)、asp16(lp163
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asp16)以及hsp17(lp163
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hsp17)过表达的植物乳杆菌菌株中P1794 mRNA的倍数变化示意图，
[0028]图5c asp17(lp163
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asp17)、asp16(lp163
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asp16)以及hsp17(lp163
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hsp17)过表达的植物乳杆菌菌株中胞外多糖产生示意图，
[0029]图5d asp17(lp163
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asp17)、asp16(lp163
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asp16)以及hsp17(lp163
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hsp17)过表达的植物乳杆菌菌株中荚膜多糖产生示意图，
[0030]图6a pCDF和pETDute的表达质粒示意图，
[0031]图6b用1.0mM异丙基
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β
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D
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硫代吡喃半乳糖苷诱导后的绿色荧光蛋白示意图，
[0032]图7碱和酸休克激活Asp16和Asp17的表达，热和冷休克激活Hsp17的表达，Autoinducer
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2激活群体感应系统中的组氨酸激酶，最终激活LuxR，Asp17、Asp16、Hsp17和LuxR蛋白与LsrR结合，从而抑制LsrR与启动子P1794之间的结合过程示意图，
[0033]图8a植物乳杆菌163野生型和lp163
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ΔlsrR细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高植物乳杆菌环境胁迫耐受性的方法，其特征在于：所述方法包括敲除转录抑制因子LsrR的步骤，所述转录抑制因子LsrR编码氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白质。2.根据权利要求1所述的提高植物乳杆菌环境胁迫耐受性的方法，其特征在于：所述转录抑制因子LsrR的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。3.根据权利要求1所述的提高植物乳杆菌环境胁迫耐受性的方法，其特征在于：通过构建转录抑制因子LsrR的敲除质粒并将其导入植物乳杆菌中，实现敲除转录抑制因子LsrR。4.根据权利要求1所述的提高植物乳杆菌环境胁迫耐受性...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟凡强，陆兆新，吕凤霞，周立邦，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：