一种采用短乳杆菌生产食品级γ-氨基丁酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种短乳杆菌高效生产食品级γ

【技术实现步骤摘要】
一种采用短乳杆菌生产食品级
γ
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氨基丁酸的方法


[0001]本专利技术涉及一种短乳杆菌高效生产“食品级”γ
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氨基丁酸（GABA）的方法，属于生物工程


技术介绍

[0002]GABA是自然界广泛存在的一种四碳非蛋白质氨基酸，广泛分布在动植物、微生物中，具有降血压、改善肝肾功能、调节激素分泌、延缓衰老等功效。在医疗、化妆品、饲料等行业均有广泛应用。
[0003]GABA的生产方法主要有化学合成法、植物富集法、微生物发酵法、全细胞（或酶）法转化法。化学法合成法的产量相对较高，但生产过程能耗高、安全性差、成本高且污染环境，生产的GABA为非“食品级”产品，不能应用于食品和医药行业。植物富集法条件比较温和，但生成的GABA产量低，因此不适合提取纯化，富含 GABA 的植物常作为功能性原料，比如中国水稻研究所开发的“基尔米”。微生物发酵法生产GABA产量较高，但存在发酵周期较长，培养基体系复杂，分离纯化困难等缺点。全细胞（或酶）法转化法具有产量高、反应条件温和、周期短、分离提纯方便等优点。尤其是全细胞转化法生产GABA可避免复杂的酶纯化过程，不但降低了成本而且提高了转化稳定性，且可循环多次转化，优势更明显。
[0004]目前，微生物发酵和全细胞转化所用的微生物主要有大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌和乳酸菌。大肠杆菌本身GAD活性很低，因此用于生产的大肠杆菌均为强化了GAD活性的基因工程菌，加之其本身会产生内毒素，生产的GABA存在一定的安全隐患，因此大肠杆菌工程菌株常用于生产饲料用GABA。谷氨酸棒杆菌缺乏GAD系统，因此采用谷氨酸棒杆菌发酵生产GABA必然要采用基因工程方法整合外源GAD系统来改造菌种，这种基因工程菌的优势在于由葡萄糖发酵生产GABA时不用添加底物谷氨酸或谷氨酸盐。当然采用基因工程菌生产的GABA有潜在的风险，不能用作“食品级”的产品。乳酸菌是公认的食品级安全菌株，但国家卫生和计划生育委员会颁布的新食品原料目录中，规定只有短乳杆菌和希氏乳杆菌生产的GABA才能作为新食品原料，其它乳酸菌发酵生产GABA只适合开发乳酸菌发酵产品，比如：含GABA的酸奶，不能分离提取GABA并作为新食品原料。
[0005]本课题组前期筛选到一株产GABA的短乳杆菌，该菌株未经任何基因工程改造，只是采用复合诱变选育和工艺优化等方法提升短乳杆菌产生GABA的能力，获得了具有竞争力的“食品级”GABA生产水平。以前针对短乳杆菌生产GABA的研究常将微生物发酵生产过程或是全细胞转化生产过程单独进行优化，而事实上发酵过程除了产生富含GABA的发酵液，还会产生大量的菌体细胞，将菌体细胞收集后可用于全细胞转化生产GABA。因此将短乳杆菌发酵与全细胞转化过程综合考虑，进行全局优化高效生产GABA，对于促进食品和医药级GABA的工业化规模生产具有十分重大的意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种短乳杆菌高效生产“食品级”GABA的新方法。
[0007]为实现以上技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一种短乳杆菌高效生产“食品级”GABA的新方法，该方法包含以短乳杆菌为生产菌种进行的种子培养、发酵培养、湿菌体制备和全细胞转化。
[0008]所用到的短乳杆菌参见：一种利用生物转化法制备γ
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氨基丁酸的方法。申请号：201510626277.X，授权公告日：2018年02月23日。
[0009]所述的发酵培养的条件为在37 ℃静置培养12～48 h。
[0010]所述发酵培养的培养基组成为：葡萄糖10～100 g/L，酵母粉10～50g/L，吐温80 2 mL/L，L
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谷氨酸钠和L
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谷氨酸共计2.04 mol/L。其中L
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谷氨酸钠为0～50g/L，L
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谷氨酸为300～257 g/L。典型的组成有：葡萄糖50 g/L，酵母粉30 g/L，吐温80 2 mL/L，L
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谷氨酸钠20g/L，L
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谷氨酸283 g/L。
[0011]所述的全细胞转化的条件为40～50 ℃、180 r/min下反应4～12 h。
[0012]所述的全细胞转化的体系组成为：湿菌体30～80 g/L，L
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谷氨酸250～650 g/L，5
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磷酸吡哆醛0.1 mmol/L，吐温80 1 mL/L。
[0013]所述的湿菌体指的是发酵培养结束后，将发酵液在4℃下，6000 r/min离心10 min获得沉淀，并用生理盐水洗涤两次，在同样条件下离心取得湿菌体。
[0014]本专利技术公开的短乳杆菌生产食品级γ
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氨基丁酸的方法与现有技术相比所具有的积极效果在于：本专利技术建立了一种短乳杆菌高效生产“食品级”GABA的方法。在优化发酵培养碳氮源浓度，底物浓度及发酵时间时不但考虑GABA的产量，而且兼顾后续转化过程所需的菌体量和GAD活性；在优化全细胞转化所需底物浓度和转化时间时，关注GABA转化产量和转化率指标。在最优的条件下，发酵36 h产GABA大于180g/L，全细胞转化6 h产GABA大于300g/L，且两个工段底物转化率均大于99%，即单次发酵与转化生产GABA周期为42 h，产量大于480g/L。本专利技术可大幅提高短乳杆菌生产GABA的效率，具有简单、易操作、产物易分离，可与现有的发酵工艺良好整合的优点。
[0015]本专利技术主要解决了微生物法生产GABA时将发酵和转化两个工段分开单独优化而忽略了两个工段的内在联系的问题，重点考察了发酵后的GABA产量、菌体量和菌体内GAD酶活，而菌体量和菌体内GAD酶活都和下一步的转化工段密切相关，关系到转化过程的GABA产量。主要的难点在于将发酵和转化两个工段整体设计考虑，这样所有的针对单一发酵或者转化的优化条件都将改变。
附图说明
[0016]下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细的说明。
[0017]图1发酵过程中葡萄糖浓度对GABA产量的影响；图2发酵过程中葡萄糖浓度对菌体生长的影响；图3不同葡萄糖浓度下发酵36 h后菌体的GAD活性；图4发酵过程中酵母粉浓度对GABA产量的影响；图5发酵过程中酵母粉浓度对菌体生长的影响；图6不同酵母粉浓度下发酵36 h后菌体的GAD活性；图7 L
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谷氨酸钠和谷氨酸比例对菌体生长的影响；
图8 L
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谷氨酸钠和谷氨酸比例对GABA产量的影响；图9 不同L
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谷氨酸钠和谷氨酸比例下发酵36 h后菌体的GAD活性；图10全细胞转化时L
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谷氨酸浓度对GABA产量的影响；图11全细胞转化时L
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谷氨酸浓度对转化率的影响。
具体实施方式
[0018]下面对本专利技术的实施例做详细说明，这里所述实施例的方案，不限于本专利技术，本领域的专业人员按照本专利技术的精神可以对其进本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种短乳杆菌高效生产食品级γ
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氨基丁酸的方法，该方法以短乳杆菌为生产菌种进行的种子培养、发酵培养、湿菌体制备和全细胞转化，其特征在于，发酵培养应考虑后续的全细胞转化过程；所述的全细胞转化体系组成为：湿菌体30～80 g/L，L
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谷氨酸250～650 g/L，5
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磷酸吡哆醛0.1 mmol/L，吐温80 1mL/L，转化在40～50℃、180 r/min下反应4～12...

【专利技术属性】
技术研发人员：张健，高强，申振豪，吐鲁洪，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：