造血干祖细胞及其制备方法和用途技术

本发明专利技术涉及生物医药领域，具体涉及造血干祖细胞及其制备方法和用途。更具体而言，本发明专利技术涉及共表达转录因子RUNX1、HOXA9和HOXA10的多能干细胞，由所述多能干细胞体外产生造血干祖细胞的方法以及所产生的造血干祖细胞，所述造血干祖细胞在移植进体内后能实现多谱系造血的重建。血的重建。

【技术实现步骤摘要】
造血干祖细胞及其制备方法和用途


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及造血干祖细胞及其制备方法和用途。更具体而言，本专利技术涉及共表达转录因子RUNX1、HOXA9和HOXA10的多能干细胞，由所述多能干细胞体外产生造血干祖细胞的方法以及所产生的造血干祖细胞，所述造血干祖细胞在移植进体内后能实现多谱系造血的重建。
[0002]专利技术背景
[0003]目前造血干细胞移植主要来源于自体移植和HLA相合的异体移植，有限的来源限制了造血干细胞移植的广泛应用。因此找到一种可替代的来源用于造血干细胞移植不失为一种好的策略。
[0004]多能干细胞(pluripotent stem cell，PSC)作为一种可以无限增殖而且具有分化成为其他细胞类型的细胞，被广泛用于研究。利用转录因子介导的细胞命运转换可以诱导PSC在体内实现短期或者长期的造血谱系重建。转录因子在造血细胞命运决定过程中发挥着重要作用，有的时候单个转录因子就可以实现细胞谱系的转换，也有的需要多个转录因子的组合在一起才决定细胞的谱系转换。转录因子RUNX1在内皮造血转换(endothelial
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to
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hematopoietic transition,EHT)过程发挥重要作用。转录因子HOXA9在造血干细胞扩增和向淋系分化的过程中发挥作用。RUNX1和HOXA9的组合可以实现体内T谱系再生(PMID:31729468)。目前已经有一些研究利用不同的转录因子组合可以实现体内短期或者长期的多谱系造血重建。例如，RUNX1、ERG、LCOR、HOXA5和HOXA9五个转录因子的组合可以诱导人的PSC实现体内多谱系再生(PMID:28514439)。FOSB、GFI1、RUNX1和SPI1可以促进人的PSC在体外再生人的多能祖细胞(MPP)，移植受体鼠之后在体内产生多谱系(PMID:25030167)。
[0005]这些研究对造血干细胞的移植来说提供了重要的理论基础，但是仍然存在很多问题：(1)这些能够体内产生多谱系的转录因子组合都是不同的，还没有一组公认的转录因子组合可以实现体内多谱系再生；(2)目前能够实现体内多谱系重建的方法大多数是利用病毒转导系统，比如是慢病毒、逆转录病毒等，这些病毒转导的基因都是随机插入宿主细胞的基因组中，具有不稳定性，不能确定之后用于移植的造血干祖细胞是否单个细胞都表达所有的转录因子组合，无法在遗传学上实现均一的转录因子组合用于PSC的诱导分化过程；(3)迄今为止，没有再生的造血干细胞移植在临床上的应用，说明已有的技术还未成熟，需要进一步研究；(4)再生造血干祖细胞谱系命运决定机制不明确。
[0006]本领域仍然需要找到特定转录因子组合，其能够稳定、高效地将PSC体外诱导分化产生可移植的造血干祖细胞(hematopoietic stem and progenitor cell,HSPC)，所述造血干祖细胞移植之后能够在体内稳定再生多谱系。
[0007]专利技术简述
[0008]在一方面，本专利技术提供一种用于产生造血干祖细胞的多能干细胞，其能够表达或共表达(例如共过表达)转录因子RUNX1、HOXA9和HOXA10，例如，所述用于产生造血干祖细胞的多能干细胞包含
[0009]i)包含转录因子RUNX1的编码核酸序列的表达构建体，
[0010]ii)包含转录因子HOXA9的编码核酸序列的表达构建体，和
[0011]iii)包含转录因子HOXA10的编码核酸序列的表达构建体，
[0012]由此所述多能干细胞能够共表达(例如共过表达)转录因子RUNX1、HOXA9和HOXA10。
[0013]在一个实施方案中，所述多能干细胞不过表达除Runx1、Hoxa9和Hoxa10之外的其他转录因子，或其不包含除RUNX1、HOXA9和HOXA10之外的其他外源的转录因子的编码核酸序列。
[0014]在一个实施方案中，所述多能干细胞是诱导性多能干细胞(iPSC)或胚胎干细胞(ESC)。
[0015]在一个实施方案中，转录因子RUNX1、HOXA9和HOXA10来自哺乳动物，例如来自小鼠、大鼠、非人灵长类动物或人，优选来自人。
[0016]在一个实施方案中，转录因子RUNX1包含选自SEQ ID NO:1
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4和8
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10的氨基酸序列；转录因子HOXA9包含选自SEQ ID NO:5
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6和11的氨基酸序列；转录因子HOXA10包含选自SEQ ID NO:7和12的氨基酸序列。
[0017]在一个实施方案中，所述RUNX1的编码核酸序列、HOXA9的编码核酸序列和HOXA10的编码核酸序列全部置于同一表达构建体。
[0018]在一个实施方案中，RUNX1、HOXA9和HOXA10的编码核苷酸序列通过内部核糖体进入位点(IRES)序列或自裂解肽的编码核苷酸序列相互连接。
[0019]在一个实施方案中，所述自裂解肽选自P2A、E2A、F2A和T2A，优选P2A。
[0020]在一个实施方案中，所述RUNX1的编码核酸序列、HOXA9的编码核酸序列、HOXA10的编码核酸序列与表达调控元件可操作地连接。
[0021]在一个实施方案中，所述表达调控元件包括启动子，例如诱导型启动子，例如强力霉素诱导型启动子。
[0022]在一个实施方案中，所述表达构建体还包括用于筛选包含所述表达构建体的多能干细胞的筛选标记，例如抗性标记、营养缺陷型标记或荧光标记，优选地，所述筛选标记是潮霉素抗性标记或嘌呤霉素抗性标记。
[0023]在一个实施方案中，所述转录因子RUNX1、HOXA9和HOXA10的表达构建体被稳定地整合进所述多能干细胞的基因组。
[0024]在一个实施方案中，所述表达构建体被靶向整合进所述多能干细胞基因组中的选定位点，例如安全位点，优选Rosa26位点或Hipp11位点。
[0025]在一个实施方案中，表达构建体通过同源重组例如序列特异性核酸酶介导的同源重组靶向整合进所述多能干细胞基因组中的选定位点。
[0026]在一方面，本专利技术提供一种产生造血干祖细胞的方法，包括：
[0027](a)提供本专利技术的多能干细胞；和
[0028](b)在使得转录因子RUNX1、HOXA9和HOXA10表达(例如共表达，优选共过表达)的条件下培养所述多能干细胞，从而产生造血干祖细胞。
[0029]在一个实施方案中，所述步骤(b)包括
[0030](b1)使所述多能干细胞定向分化成生血内皮细胞；和
[0031](b2)使所述生血内皮细胞与基质细胞共培养，由此生成造血干祖细胞。
[0032]在一个实施方案中，所述步骤(b1)包括：
[0033]在第一培养基中使所述多能干细胞形成拟胚体(EB)并培养第一时间段；
[0034]在第二培养基培养EB第二时间段；
[0035]在第三培养基培养EB第三时间段本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于产生造血干祖细胞的多能干细胞，其能够表达或共表达(例如共过表达)转录因子RUNX1、HOXA9和HOXA10，例如，所述用于产生造血干祖细胞的多能干细胞包含i)包含转录因子RUNX1的编码核酸序列的表达构建体，ii)包含转录因子HOXA9的编码核酸序列的表达构建体，和iii)包含转录因子HOXA10的编码核酸序列的表达构建体，由此所述多能干细胞能够共表达(例如共过表达)转录因子RUNX1、HOXA9和HOXA10。2.权利要求1的多能干细胞，其不过表达除Runx1、Hoxa9和Hoxa10之外的其他转录因子，或其不包含除RUNX1、HOXA9和HOXA10之外的其他外源的转录因子的编码核酸序列。3.权利要求1或2的多能干细胞，其是诱导性多能干细胞(iPSC)或胚胎干细胞(ESC)。4.权利要求1
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3中任一项的多能干细胞，其中转录因子RUNX1、HOXA9和HOXA10来自哺乳动物，例如来自小鼠、大鼠、非人灵长类动物或人，优选来自人；优选地，其中转录因子RUNX1包含选自SEQ ID NO:1
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4和8
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10的氨基酸序列；转录因子HOXA9包含选自SEQ ID NO:5
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6和11的氨基酸序列；转录因子HOXA10包含选自SEQ ID NO:7和12的氨基酸序列；优选地，其中所述RUNX1的编码核酸序列、HOXA9的编码核酸序列和HOXA10的编码核酸序列全部置于同一表达构建体；优选地，其中RUNX1、HOXA9和HOXA10的编码核苷酸序列通过内部核糖体进入位点(IRES)序列或自裂解肽的编码核苷酸序列相互连接；优选地，其中所述自裂解肽选自P2A、E2A、F2A和T2A，优选P2A；优选地，其中所述RUNX1的编码核酸序列、HOXA9的编码核酸序列、HOXA10的编码核酸序列与表达调控元件可操作地连接；优选地，其中所述表达调控元件包括启动子，例如诱导型启动子，例如强力霉素诱导型启动子；优选地，其中所述表达构建体还包括用于筛选包含所述表达构建体的多能干细胞的筛选标记，例如抗性标记、营养缺陷型标记或荧光标记，优选地，所述筛选标记是潮霉素抗性标记或嘌呤霉素抗性标记；优选地，其中所述转录因子RUNX1、HOXA9和HOXA10的表达构建体被稳定地整合进所述多能干细胞的基因组；优选地，其中所述表达构建体被靶向整合进所述多能干细胞基因组中的选定位点，例如安全位点，优选Rosa26位点或Hipp11位点；优选地，其中表达构建体通过同源重组例如序列特异性核酸酶介导的同源重组靶向整合进所述多能干细胞基因组中的选定位点。5.一种产生造血干祖细胞的方法，包括：(a)提供权利要求1
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4中任一项的多能干细胞；和(b)在使得转录因子RUNX1、HOXA9和HOXA10表达(例如共表达，优选共过表达)的条件下培养所述多能干细胞，从而产生造血干祖细胞。6.权利要求5的方法，其中所述步骤(b)包括(b1)使所述多能干细胞定向分化成生血内皮细胞；和
(b2)使所述生血内皮细胞与基质细胞共培养，由此生成造血干祖细胞。7.权利要求6的方法，其中所述步骤(b1)包括：在第一培养基中使所述多能干细胞形成拟胚体(EB)并培养第一时间段；在第二培养基培养EB第二时间段；在第三培养基培养EB第三时间段；和任选地，收获生成的生血内皮细胞。8.权利要求7的方法，其中所述第一时间段为1
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5天，可选的大约2
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3天；所述第二时间段2
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7天，可选的大约3
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4天；和/或所述第三时间段为2
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10天，可选的大约4
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6天。9.权利要求7或8的方法，其中在第一培养基中通过悬滴法使所述多能干细胞形成拟胚体(EB)。10.权利要求7
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9中任一项的方法，其中所述第一培养基为含有胎牛血清、铁饱和转铁蛋白、硫代甘油、L
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丙氨酰
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L
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谷氨酰胺、抗坏血酸和骨形态发生蛋白4的IMDM培养基，优选地，所述第一培养基为含有大约10
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25v％胎牛血清、大约170
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250μg/mL铁饱和转铁蛋白、大约0.2
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0.8mM硫代甘油、大约1
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5mM L
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丙氨酰
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L
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谷氨酰胺、大约30
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80μg/ml抗坏血酸和大约2
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10ng/mL骨形态发生蛋白4的IMDM培养基，更优选地，所述第一培养基为含有大约15v％胎牛血清、大约200μg/mL铁饱和转铁蛋白、大约0.45mM硫代甘油、大约2mM L
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丙氨酰
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L
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谷氨酰胺、大约50μg/mL抗坏血酸和大约5ng/mL骨形态发生蛋白4的IMDM培养基。11.权利要求7
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10中任一项的方法，其中所述第二培养基为含有胎牛血清、铁饱和转铁蛋白、硫代甘油、L
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丙氨酰
‑
L
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谷氨酰胺、抗坏血酸、骨形态发生蛋白4和血管内皮生长因子的IMDM培养基；优选地，所述第二培养基为含有大约10
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25v％胎牛血清、大约170
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250μg/mL铁饱和转铁蛋白、大约0.2
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0.8mM硫代甘油、大约1
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5mM L
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丙氨酰
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L
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谷氨酰胺、大约30
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80μg/ml抗坏血酸、大约2
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10ng/mL骨形态发生蛋白4和大约2
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15ng/mL血管内皮生长因子的IMDM培养基；更优选地，所述第二培养基为含有大约15v％胎牛血清、大约200μg/mL铁饱和转铁蛋白、大约0.45mM硫代甘油、大约2mM L
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丙氨酰
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L
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谷氨酰胺、大约50μg/mL抗坏血酸、大约5ng/mL骨形态发生蛋白4和大约5ng/mL血管内皮生长因子的IMDM培养基。12.权利要求7
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11中任一项的方法，其中所述第三培养基为含有胎牛血清、铁饱和转铁蛋白、硫代甘油、L
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丙氨酰
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L
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谷氨酰胺、抗坏血酸、白介素3、白介素6、干细胞因子、FMS样酪氨酸激酶3配...

【专利技术属性】
技术研发人员：王金勇，彭欢，张梦云，吴冰燕，刘丽娟，胡房晓，夏成祥，刘晓飞，
申请(专利权)人：北京干细胞与再生医学研究院，
类型：发明
国别省市：