一种低表达E-cadherin的外泌体、其制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种低表达E

【技术实现步骤摘要】
一种低表达E
‑
cadherin的外泌体、其制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及肿瘤免疫领域，尤其涉及一种低表达E
‑
cadherin的外泌体的制备及应用。

技术介绍

[0002]近年来，基于肿瘤细胞来源的外泌体(Tumor cell derived exosomes，TDE)的癌症疫苗在体外和动物模型显示出良好的肿瘤免疫治疗效果，但在临床试验中的效果不尽如意。究其原因，一方面TDE具有亲代肿瘤细胞相关抗原，具有诱导抗肿瘤免疫的潜能；另一方面，外泌体携带PD
‑
L1等多种免疫抑制分子，从而抑制抗肿瘤免疫。因此，从肿瘤细胞直接获取的TDEs并不能诱导强的抗肿瘤活性，如何增强TDE的肿瘤免疫治疗效果，是本领域亟需解决的技术问题。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的之一，就在于提供一种低表达E
‑
cadherin的外泌体，以解决上述问题。
[0004]为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是这样的：一种低表达E
‑
cadherin的外泌体，所述外泌体的E
‑
cadherin装载量为常规外泌体的9.0％
‑
11.2％。
[0005]上述外泌体，与常规的外泌体相比，其装载的E
‑
cadherin蛋白表达明显下降。外泌体中E
‑
cadherin蛋白表达下调越多，对CD8+T细胞的细胞毒性及增殖潜能增强作用越明显；所述的常规外泌体是指正常表达E
‑
cadherin的HCC827细胞分泌的外泌体。
[0006]作为优选的技术方案：所述低表达E
‑
cadherin的细胞为HCC827
‑
CDH1
KD
细胞系HCC827shEcad
‑
1及HCC827shEcad
‑
2。
[0007]该细胞系HCC827shEcad
‑
1及HCC827shEcad
‑
2能稳定的低表达E
‑
cadherin，从而分泌得到含有大量低表达E
‑
cadherin的外泌体。
[0008]作为优选的技术方案，上述HCC827
‑
CDH1
KD
细胞系HCC827shEcad
‑
1及HCC827shEcad
‑
2的制备方法为，包括下述步骤：
[0009](1)PLKO.1
‑
Puro
‑
TRC
‑
E
‑
cadherin质粒构建:合成E
‑
cadherin的shRNA序列1及序列2，然后将所述E
‑
cadherin的shRNA序列装载到PLKO.1
‑
Puro
‑
TRC载体上，得到PLKO.1
‑
Puro
‑
TRC
‑
E
‑
cadherin质粒1及PLKO.1
‑
Puro
‑
TRC
‑
E
‑
cadherin质粒2；
[0010](2)慢病毒的制备：分别用含有PLKO.1
‑
Puro
‑
TRC
‑
E
‑
cadherin质粒1或质粒2、pCMV
‑
dR8.91和VSV
‑
G三种质粒的混合液转染HEK293T细胞；培养转染后的HEK293T细胞，收集培养液，对培养液进行处理得到包装有E
‑
cadherinshRNA
‑
1及E
‑
cadherinshRNA
‑
2的慢病毒；
[0011](3)HCC827
‑
CDH1
KD
细胞系的建立：分别用含有E
‑
cadherin shRNA
‑
1或E
‑
cadherin shRNA
‑
2慢病毒悬液、1640培养基和polybrene的混合液感染HCC827细胞；感染后的HCC827细胞继续培养，并使用嘌呤霉素筛选，获得低表达E
‑
cadherin的HCC827
‑
CDH1
KD
细胞系
HCC827shEcad
‑
1及HCC827shEcad
‑
2。
[0012]通过上述方法制备得到的低表达E
‑
cadherin的HCC827细胞系HCC827shEcad
‑
1及HCC827shEcad
‑
2能持续稳定的低表达E
‑
cadherin，得到的外泌体中E
‑
cadherin的含量为常规外泌体的9.0％
‑
11.2％，稳定性好。
[0013]进一步优选的，上述步骤(1)中，合成E
‑
cadherin的shRNA序列的方法为：设计E
‑
cadherin的shRNA序列1及序列2，并于NCBI进行验证；采用固相亚磷酰胺三酯法合成；采用的E
‑
cadherin的shRNA序列分别为具有SEQ.ID NO:1和SEQ.ID NO:2的序列；
[0014]SEQ.ID NO:1的序列为：
[0015]CCGGACCGATGACAACAAGCTCGAGCTTGTTGTCATTCTGATCGGTTTTTTG；
[0016]SEQ.ID NO:2的序列为：
[0017]CCGGGAACGAGGCTAACGTCGTAATCTCGAGATTACGACGTTAGCCTCGTTCTTTTTG。
[0018]其中,上述步骤(1)中使用的慢病毒载体PLKO.1
‑
Puro
‑
TRC含有AMP抗性，便于后续用嘌呤霉素筛选出转染成功的细胞。PLKO.1
‑
Puro
‑
TRC载体具有5
’
酶切位点AgeI及3
’
酶切位点EcoRI。
[0019]进一步优选的，步骤(1)中，将E
‑
cadherin shRNA序列1或序列2载入到PLKO.1
‑
Puro
‑
TRC载体上的方法为：将E
‑
cadherinshRNA序列1或序列2及PLKO.1
‑
Puro
‑
TRC载体都用AgeI和EcoRI进行双酶切后，用T4 DNA连接酶进行连接本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种低表达E
‑
cadherin的外泌体，其特征在于：所述外泌体的E
‑
cadherin装载量为常规外泌体的9.0%
‑
11.2%。2.根据权利要求1所述的低表达E
‑
cadherin的外泌体，其特征在于：所述低表达E
‑
cadherin的细胞为HCC827
‑
CDH1
KD
细胞系。3.权利要求1
‑
2任意一项的低表达E
‑
cadherin的外泌体的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：（1）制备低表达E
‑
cadherin的HCC827细胞；（2）将步骤（1）所得的低表达E
‑
cadherin的HCC827细胞在无外泌体的1640培养基中进行培养，培养完成后，收集培养液；（3）将步骤（2）收集到的培养液进行梯度离心，得到含有低表达E
‑
cadherin的的外泌体。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述HCC827
‑
CDH1
KD
细胞系HCC827shEcad
‑
1及HCC827shEcad
‑
2的制备方法为，包括下述步骤：1）PLKO.1
‑
Puro
‑
TRC
‑
E
‑
cadherin质粒构建:合成E
‑
cadherin的shRNA序列1及序列2，然后将所述E
‑
cadherin的shRNA序列装载到PLKO.1
‑
Puro
‑
TRC载体上，得到PLKO.1
‑
Puro
‑
TRC
‑
E
‑
cadherin质粒1及PLKO.1
‑
Puro
‑
TRC
‑
E
‑
cadherin质粒2；2）慢病毒的制备：分别用含有PLKO.1
‑
Puro
‑
TRC
‑
E
‑
cadherin质粒1或质粒2、pCMV
‑
dR8.91和VSV
‑
G三种质粒的混合液转染HEK293T细胞；培养转染后的HEK293T细胞，收集培养液，对培养液进行处理得到包装有E
‑
cadherin shRNA
‑
1及E
...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹邦荣，路顺，曾娟，马士淇，赵越，周杰，
申请(专利权)人：四川省肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：