一种获得高阳性率CAR-T细胞的方法技术

本发明专利技术属于医药生物技术领域，具体为一种获得高阳性率CAR

【技术实现步骤摘要】
一种获得高阳性率CAR
‑
T细胞的方法


[0001]本专利技术涉及医药生物
，具体为一种获得高阳性率CAR
‑
T细胞的方法。

技术介绍

[0002]癌症现在已成为人类健康的头号杀手，快速的生活节奏、巨大的工作压力、不健康的饮食习惯、糟糕的环境都是癌症发生的帮凶，使得癌症的高发率和年轻化趋势也越来越明显。目前常用的治疗手段效果十分有限，仍需探索一个更加有效的治疗方法，来提高癌症患者的生存率和生存质量。
[0003]针对恶性肿瘤的免疫治疗近年来发展迅速，取得了令人瞩目的临床疗效。自2011年，Nature及临床肿瘤最顶级杂志JCO分别发表相同题目“肿瘤免疫治疗的时代已经来临”的评论文章(Nature.2011；480(7378):480；JClinOncol.2011；29(36):4828)，肿瘤免疫细胞治疗迎来新一轮的研究热潮。
[0004]嵌合抗原受体T细胞疗法作为肿瘤免疫治疗的重要分支之一，在恶性血液肿瘤中已经取得了非常好的疗效，对复发难治性B细胞白血病的完全缓解率超过90％。2017年8月，美国FDA批准了诺华的tisagenlecleucel嵌合抗原受体T细胞(CAR
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T细胞)治疗用于治疗儿童和年轻成年患者急性淋巴细胞性白血病(ALL)，成为第一个批准上市的CAR
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T药物。紧接着同年10月，美国FDA又宣布批准了Kite Pharma的CAR
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T疗法Yescarta上市，治疗罹患特定类型的大B细胞淋巴瘤成人患者。CAR
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T药物的陆续获批使得CAR
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T治疗迈上了一个新的台阶。
[0005]嵌合抗原受体是一种人工合成受体，它通常包含胞外抗原结合域、跨膜铰链区和胞内信号转导区。通过将识别肿瘤相关抗原(tumor associated antigen,TAA)的抗体单链可变区(single
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chain fragment variable，scFv)和胞内信号域“免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine
‑
based activation motifs，ITAM)”在体外进行基因重组。再通过病毒或其它载体系统将其导入T细胞中，这样经过基因改造的T细胞称之为嵌合型抗原受体T细胞(即CAR
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T细胞)。CAR
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T细胞在体外经大规模扩增后，回输到患者体内，能够以非MHC限制性的模式表现强效的抗癌作用。
[0006]但是，目前CAR
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T细胞治疗总体疗效仍不尽如人意，尤其是针对实体瘤。其中转染效率低，难以获得高阳性率的CAR
‑
T细胞是一个很重要的原因。为此，我们提出一种获得高阳性率CAR
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T细胞的方法。

技术实现思路

[0007]本部分的目的在于概述本专利技术的实施方式的一些方面以及简要介绍一些较佳实施方式。在本部分以及本申请的说明书摘要和专利技术名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和专利技术名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本专利技术的范围。
[0008]鉴于现有技术中存在的问题，提出了本专利技术。
[0009]因此，本专利技术的目的是提供一种获得高阳性率CAR
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T细胞的方法，可支持细胞培养长时间不换液，减少换液频率，减少操作，并且细胞培养过程中不需要摇晃，在普通的CO2培养箱中静止培养即可。
[0010]为解决上述技术问题，根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了如下技术方案：
[0011]一种获得高阳性率CAR
‑
T细胞的方法，其包括如下步骤：
[0012]步骤1：选取合适的G
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Rex生物反应器，同时设定好G
‑
Rex生物反应器的参数，在封闭系统G
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REX100M
‑
CS中进行操作；
[0013]步骤2：解冻和激活PBMC，PBMC在40ML培养基中复苏，激活；
[0014]步骤3：转导，将Vectofusin
‑
1和病毒液加到G
‑
REX100M
‑
CS中；
[0015]步骤4：继续添加培养基，将培养基加到最大体积；
[0016]步骤5：每天取上清液，检测葡萄糖浓度和乳酸盐浓度，同时每三天添加一次细胞因子；
[0017]步骤6：收获细胞。
[0018]作为本专利技术所述的一种获得高阳性率CAR
‑
T细胞的方法的一种优选方案，其中：所述步骤1中G
‑
Rex生物反应器选用美国Wilson Wolf Manufacturing为T细胞免疫疗法研发的一款用于T细胞培养的装置。
[0019]作为本专利技术所述的一种获得高阳性率CAR
‑
T细胞的方法的一种优选方案，其中：所述步骤3中Vectofusin
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1(MiltenyiBiotec Inc.,Auburn,CA,USA)是一种合成肽，当加入到病毒和细胞的溶液中时，可以增强病毒转导，Vectofusin
‑
1形成a
‑
螺旋状纳米纤维，与病毒颗粒结合增强病毒
‑
细胞相互作用。
[0020]作为本专利技术所述的一种获得高阳性率CAR
‑
T细胞的方法的一种优选方案，其中：所述步骤4中培养基最大体积为1L。
[0021]作为本专利技术所述的一种获得高阳性率CAR
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T细胞的方法的一种优选方案，其中：所述步骤6中，收获细胞后需要，再将细胞注入实验用离心机中提纯，获取高阳性率CAR
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T细胞。
[0022]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：G
‑
REX培养瓶通过底透气膜使O2和CO2得到充分交换，一次性加入大量培养基可支持细胞培养长时间不换液，减少换液频率，减少操作，并且细胞培养过程中不需要摇晃，在普通的CO2培养箱中静止培养即可。操作步骤简单，花费时间短，且成本低，经济效益高
附图说明
[0023]为了更清楚地说明本专利技术实施方式的技术方案，下面将结合附图和详细实施方式对本专利技术进行详细说明，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
[0024]图1为本专利技术步骤流程结构示意图；
[0025]图2为本专利技术与传统方法的细胞数对比；
[0026]图3为本专利技术与传统方法的扩增倍数对比；
[0027]图4为本专利技术与传统方法的时间对比；
[0028]图5为本专利技术与传统方法的价格对比。
具体实施方式
[0029]为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种获得高阳性率CAR
‑
T细胞的方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤1：选取合适的G
‑
Rex生物反应器，同时设定好G
‑
Rex生物反应器的参数，在封闭系统G
‑
REX100M
‑
CS中进行操作；步骤2：解冻和激活PBMC，PBMC在40ML培养基中复苏，激活；步骤3：转导，将Vectofusin
‑
1和病毒液加到G
‑
REX100M
‑
CS中；步骤4：继续添加培养基，将培养基加到最大体积；步骤5：每天取上清液，检测葡萄糖浓度和乳酸盐浓度，同时每三天添加一次细胞因子；步骤6：收获细胞。2.根据权利要求1所述的一种获得高阳性率CAR
‑
T细胞的方法，其特征在于：所述步骤1中G
‑
Rex生物反应器选用美国WilsonWolfManu...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙丽东，
申请(专利权)人：吉林省大丽科技有限公司，
类型：发明
国别省市：