稳定表达CAR的NK细胞及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种稳定表达CAR的NK细胞及其制备方法与应用。将靶向癌细胞表面抗原的CAR基因以非病毒质粒的形式导入NK细胞，CAR稳定表达2周以上，经体外扩增的CAR

【技术实现步骤摘要】
稳定表达CAR的NK细胞及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及免疫治疗领域，具体地说，涉及一种稳定表达CAR的NK细胞及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是机体天然免疫系统的重要组成部分，在监视肿瘤早期恶性转化、清除肿瘤细胞及病毒、调控免疫系统反应等过程中具有关键作用。与T、B细胞不同，NK细胞发挥功能无需预先致敏，且无组织相容性复合体MHC限制性，在过继性免疫细胞治疗中能实现异体化使用。
[0003]嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，即CAR)是一种人工设计的含多个功能区的单链跨膜蛋白，它可以嵌入T、NK、巨噬细胞膜表面，将抗原抗体结合机制和细胞的杀伤作用结合，从而特异性地杀伤肿瘤或其他病变细胞。近十年来，CAR
‑
T细胞的制备技术发展迅速，CAR
‑
T产品在治疗血液淋巴细胞瘤疗效显著，其已在多个国家批准上市，作为治疗B系淋巴细胞白血病及淋巴瘤的有效手段。然而，CAR
‑
T治疗多以患者自体来源的T细胞制备使用为主，其存在以下弊端：1)肿瘤细胞污染的可能；2)患者来源T细胞功能异常，无法发挥功能或实现体外扩增；3)生产制备过程中患者的疾病进展；4)价格昂贵等。此外，CAR
‑
T治疗引起的细胞因子风暴往往带来严重的不良反应，危及患者生命。CAR
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NK在抗肿瘤过程中不会释放包括IL
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6在内的大量细胞因子，因此不会引起严重的细胞因子风暴，较CAR
‑
T治疗安全。过继性移植异基因NK细胞的试验也证明其几乎不存在移植物宿主病GvHD、细胞因子释放综合征(CRS)或神经毒性。
[0004]CAR
‑
T的制备一般普遍采用慢病毒或逆转录病毒将CAR转入T细胞，但是这种转染方法会导致T细胞基因组因病毒基因组随机嵌入发生随机突变。此外，病毒载体的价格昂贵直接造成CAR
‑
T治疗费用高昂，无法实现临床大量推广使用，非病毒载体的使用能有效规避以上问题。
[0005]综上，慢病毒和逆转录病毒对NK细胞的基因组修饰会引入病毒元件从而带来一定的安全隐患；而相对于T细胞而言，NK细胞的基因改造难度较大，一直是待解决的技术瓶颈问题；且非病毒质粒转染CAR
‑
NK细胞具有转染效率低及不稳定的问题；此外，NK细胞本身较难在体外体系中扩增。因此，若能开发出一种非病毒载体高效转染CAR的NK制备方法，且实现CAR
‑
NK的体外稳定扩增，则能够有效规避病毒载体制备自体CAR
‑
T细胞的弊端，推进过继性异体CAR
‑
NK的应用。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种稳定表达CAR的NK细胞及其制备方法与应用。
[0007]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种稳定表达CAR的NK细胞的制备方法，所述方法包括：将靶向癌细胞表面抗原HER2的CAR基因通过PB转座子系统导入NK细胞中。
[0008]所述靶向癌细胞表面抗原HER2的CAR基因选自基于第一代、第二代或第三代CAR
‑
T技术构建的CAR基因。
[0009]优选地，所述靶向癌细胞表面抗原HER2的CAR基因为基于第三代CAR
‑
T技术构建的CAR基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0010]所述PB转座子系统包括重组转座子质粒(PiggyBac Her2
‑
CAR
‑
puro)和PB转座酶质粒(Super PiggyBac Transposase expression vector)。
[0011]进一步地，所述重组转座子质粒的构建方法包括：
[0012](1)人工合成靶向癌细胞表面抗原HER2的CAR基因序列；
[0013](2)pCDH
‑
EF1
‑
MCS
‑
T2A
‑
Puro载体经酶切分离出T2A
‑
Puro基因片段(SEQ ID NO:2)；
[0014](3)将CAR基因序列、T2A
‑
Puro基因片段插入转座子载体PB
‑
EF1
‑
MCS
‑
IRES
‑
Neo的XbaⅠ和SalⅠ酶切位点之间，以取代MCS
‑
IRES
‑
Neo元件。
[0015]进一步地，采用电转化的方法将所述PB转座子系统转入NK细胞，获得转染的CAR
‑
NK细胞。
[0016]还包括对CAR
‑
NK细胞进行体外扩增培养的步骤，具体如下：
[0017]将所述CAR
‑
NK细胞与CD2/CD335磁珠(将CD2和CD335生物素抗体包被于磁珠颗粒上)接触，并加入200
‑
800IU/ml IL
‑
2、20
‑
60ng/ml IL
‑
21和30
‑
100ng/ml IL
‑
15(优选500IU/ml IL
‑
2、30ng/ml IL
‑
21和50ng/ml IL
‑
15)进行共培养。
[0018]优选地，所述CAR
‑
NK细胞与CD2/CD335磁珠的个数比为1:(0.5
‑
5)，优选1:2。
[0019]优选地，所述NK细胞为脐带血来源的NK细胞。
[0020]第二方面，本专利技术提供按照所述方法制备的稳定表达CAR的NK细胞。
[0021]第三方面，本专利技术提供所述稳定表达CAR的NK细胞在制备抗肿瘤药物或组合物中的应用。
[0022]优选地，所述肿瘤为HER2阳性肿瘤。
[0023]第四方面，本专利技术提供一种抗肿瘤药物或组合物，其有效成分为所述稳定表达CAR的NK细胞。
[0024]借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：
[0025](一)本专利技术解决了CAR
‑
NK制备方法面临的CAR阳性率不高及细胞扩增数量有限的问题，满足临床上对于CAR
‑
NK细胞的需求。并可有效规避慢病毒和逆转录病毒对NK细胞的基因组修饰所产生的不利效应，且可以规避在NK细胞内引入任何慢病毒或逆转录病毒元件。
[0026](二)本专利技术首次提供一种通过非病毒质粒稳定表达CAR的NK细胞及其制备方法，将所构建的非病毒重组质粒通过电转的方法导入NK细胞后，可以使之稳定表达2周以上，并且可有效提高NK细胞CAR转染效率(>85％)。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.稳定表达CAR的NK细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括：将靶向癌细胞表面抗原HER2的CAR基因通过PB转座子系统导入NK细胞中。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶向癌细胞表面抗原HER2的CAR基因选自基于第一代、第二代或第三代CAR
‑
T技术构建的CAR基因。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述靶向癌细胞表面抗原HER2的CAR基因为基于第三代CAR
‑
T技术构建的CAR基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PB转座子系统包括重组转座子质粒和PB转座酶质粒；所述重组转座子质粒的构建方法包括：(1)人工合成靶向癌细胞表面抗原HER2的CAR基因序列；(2)pCDH
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EF1
‑
MCS
‑
T2A
‑
Puro载体经酶切获得T2A
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Puro基因片段；(3)将CAR基因序列、T2A
‑
Puro基因片段插入转座子载体PB
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EF1
‑
MCS
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IRES
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Neo的XbaⅠ和SalⅠ酶切位点之间，以取代MCS
‑
IRE...

【专利技术属性】
技术研发人员：李琳，侯宗柳，孟明耀，李田田，赵旖旖，杨丽黎，郭洋帆，
申请(专利权)人：李琳，
类型：发明
国别省市：