可视化指示NF-κB信号的神经干细胞系及其构建方法与应用技术

本发明专利技术涉及生物医药技术领域，尤其是一种可视化指示NF

【技术实现步骤摘要】
可视化指示NF
‑
κ
B信号的神经干细胞系及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，尤其涉及一种可视化指示NF
‑
κB信号的神经干细胞系及其构建方法与应用。
技术背景
[0002]调查显示，全世界已有数千万的神经退行性疾病患者，包括阿尔茨海默病(AD)，帕金森病(PD)，运动神经元疾病(MND)，亨廷顿病(HD)，多发性硬化症(MS)等。中国人口众多，AD的发病率约为1％，年龄每增加5岁，AD的患病率约增加1倍，目前全球已有约5000万左右的阿尔茨海默病患者，约1/3病例发生在中国。随着老龄人口的快速增加和寿命的延长，此类疾病呈高发趋势，为家庭和国家医疗带来了极大的负担。
[0003]因此，随着老龄化社会的到来，能够预防或治疗阿尔兹海默症等神经退行性疾病的药物具有非常重大的社会意义。传统的检测药物抑制炎症效果的体外实验有免疫印迹、荧光定量PCR等，通过检测相关炎性因子的表达水平来进行判断，但这些手段费时费力费钱，且通常需要裂解细胞，不能在活体水平进行测试，当细胞样本比较珍贵时，这些手段显得有些不足。因此目前市面上急需一款能够模拟人神经系统，并快速对神经相关疾病进程进行反应的检测工具。

技术实现思路

[0004]为解决上述问题，本专利旨在构建一种可视化指示NF
‑
κB信号的神经干细胞系，为针对以NF
‑
κB信号通路为靶点的阿尔兹海默症等神经性疾病相关药物研发、筛选以及机理的研究提供一种人源的、简便的、可视化评估工具。
[0005]为达到上述目的，本专利采用具体以下技术方案予以实现：
[0006]本专利技术第一方面提供了一种可视化指示NF
‑
κB信号的神经干细胞系，其微生物保藏编号是：C2022370，分类命名是：人源神经干细胞系NPC
‑
NF
‑
κB
‑
mcherry，保藏日期是：2023年04月11日。保藏单位：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。
[0007]本专利技术第二方面提供了一种可视化指示NF
‑
κB信号的神经干细胞系的构建方法，包括以下步骤：
[0008](1)：构建lenti
‑
NF
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κB
‑
mcherry真核细胞表达载体；将NF
‑
κB结合序列作为启动子的组成部分克隆到mcherry报告基因载体中，引导红色荧光蛋白mcherry的转录，得到所述的真核表达载体；
[0009](2)：将(1)所述的真核表达载体lenti
‑
NF
‑
κB
‑
mcherry和病毒包装载体pCMV
‑
VSV
‑
G、pCAG
‑
dR8.9共转至工具细胞HEK 293T进行慢病毒包装；
[0010](3)：用慢病毒感染目的细胞H9
‑
NPC，通过有限稀释法获取阳性克隆进行扩大培养，构建可视化指示NF
‑
κB信号的人源神经干细胞系。
[0011]优选地，其特征在于，所述NF
‑
κB结合序列的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
[0012]优选地，步骤(2)中pCMV
‑
VSV
‑
G载体、pCAG
‑
dR8.9载体和目的基因载体lenti
‑
NF
‑
κB
‑
mcherry三种质粒加入比为0.1：2：4。
[0013]本专利技术第三方面提供了一种第一方面所述的可视化指示NF
‑
κB信号的神经干细胞系在药物筛选中的应用。
[0014]优选地，其特征在于，所述的药物以NF
‑
κB信号通路为治疗靶点。
[0015]优选地，其特征在于，使用NF
‑
κB信号通路激活剂处理细胞，引发细胞炎症反应，按时间梯度进行刺激，通过荧光显微镜和免疫印迹实验测试细胞NF
‑
κB表达水平是否与红色荧光强度呈正相关。
[0016]优选地，其特征在于，所述的NF
‑
κB信号通路激活剂包含但不限于TNF
‑
α，使用浓度为1nM
‑
1uM。
[0017]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0018](1)本专利技术提供的构建细胞系的技术简便快捷、成本较低；且相比于小鼠来源的细胞，使用人神经干细胞制备稳转细胞系来进行药物筛选，更接近人脑炎症反应的发生与发展的真实水平。
[0019](2)本专利技术通过慢病毒感染的方式，将可视化指示细胞炎性水平的lenti
‑
NF
‑
κB
‑
mcherry报告基因质粒导入细胞，可以保证该细胞的长久性和稳定性。
[0020](3)该细胞在NF
‑
κB信号通路激动剂的处理下，具有阿尔兹海默症等疾病存在的神经炎性特征，为以NF
‑
κB信号通路为靶点的相关药物的研发与筛选以及机理研究提供体外细胞研究平台可能。
[0021](4)该细胞是在活细胞水平对药物效果进行评价，评价完成后细胞可重复利用。
[0022](5)该细胞的来源为人源神经干细胞，更能够真实的反应人脑疾病的发生和发展过程。
附图说明
[0023]图1lenti
‑
NF
‑
κB
‑
mcherry质粒的载体图谱；
[0024]图2lenti
‑
NF
‑
κB
‑
mcherry质粒的测序峰图结果；
[0025]图3倒置荧光显微镜下观察293T细胞的红色荧光蛋白表达，确认慢病毒的包装效率达到95％以上；其中(a)明场；(b)红色荧光通道；
[0026]图4倒置荧光显微镜下观察NPC细胞的红色荧光蛋白表达，确认目的质粒已成功导入NPC细胞；其中(a)明场；(b)红色荧光通道；
[0027]图5实时荧光监测NF
‑
κB激动剂刺激后不同时间点的NPC稳转细胞系荧光强度的信号变化结果，其中(a)随着激动剂刺激时间的增长，荧光信号逐步被激发；(b)荧光强度的定量结果；
[0028]图6Western blot检测NPC
‑
NF
‑
κB
‑
mcherry细胞的NF
‑
κB蛋白表达量；其中，(a)目的蛋白NF
‑
κB随时间表达量增加；(b)定量结果。
具体实施方式
[0029]下面对结合说明书附图本专利技术作进一步的说明，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可视化指示NF
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κB信号的神经干细胞系，其特征在于，其保藏编号是：C2022370，分类命名是：人源神经干细胞系NPC
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NF
‑
κB
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mcherry，保藏日期是：2023年04月11日。保藏单位：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。2.一种可视化指示NF
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κB信号的神经干细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)：构建lenti
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NF
‑
κB
‑
mcherry真核细胞表达载体；将NF
‑
κB结合序列作为启动子的组成部分克隆到mcherry报告基因载体中，引导红色荧光蛋白mcherry的转录，得到所述的真核表达载体；(2)：将(1)所述的真核表达载体lenti
‑
NF
‑
κB
‑
mcherry和病毒包装载体pCMV
‑
VSV
‑
G、pCAG
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dR8.9共转至工具细胞HEK 293T进行慢病毒包装；(3)：用慢病毒感染目的细胞H9
‑
NPC，通过有限稀释法获取阳性克隆...

【专利技术属性】
技术研发人员：管莹，李萌，朱洲海，彭琪媛，
申请(专利权)人：云南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：