一种肝细胞癌诊断治疗的应用方法技术

本发明专利技术公开了一种肝细胞癌诊断治疗的应用方法，属于分子诊断治疗技术领域，分别利用常氧及1％氧气处理肝细胞癌细胞SNU

【技术实现步骤摘要】
一种肝细胞癌诊断治疗的应用方法


[0001]本专利技术属于分子诊断治疗
，尤其涉及一种肝细胞癌诊断治疗的应用方法。

技术介绍

[0002]肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是几十年来死亡率增速最快的恶性肿瘤之一，患者整体的5年生存率低于20％。尽管经导管动脉栓塞、靶向血管新生的酪氨酸激酶抑制剂等取得了一定效果，但由此导致的肿瘤缺氧微环境却引起了患者放化疗抵抗，甚至复发和转移严重影响了患者的预后，成为限制HCC治疗的瓶颈问题肝细胞是导致HCC患者死亡率剧增的根本原因。
[0003]缺氧条件下肿瘤细胞以线粒体氧化磷酸化功能抑制为基础的能量代谢转变是导致肿瘤细胞侵袭和转移的关键。线粒体作为氧最直接的感受器，其氧化磷酸化系统受到核
‑
线粒体双基因组的调节，仅从传统的细胞核转录角度不能完全解释缺氧在线粒体能量调节中的作用。有研究提出缺氧还可能抑制线粒体DNA(mtDNA)编码蛋白翻译，因此本方案以mtDNA编码蛋白翻译的调控机制为切入点，阐明缺氧微环境中线粒体能量代谢转变的机制，为抑制缺氧导致的HCC侵袭迁移提供新的突破口。
[0004]tRFs(tRNA
‑
derived fragments)作为缺氧等应激信号的传递者，在肿瘤细胞生存、干性表型维持、肿瘤微环境重塑和能量代谢转换中扮演重要角色。穿梭于细胞核和胞浆的tRNA含量为mRNA的60
‑
100倍，被认为是翻译信号的核心分子之一。缺氧造成的能量应激、ROS等促进核糖核酸酶在T
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loop、D
‑
loop以及反密码子区等位点切割tRNA，产生的tRFs具有调控蛋白质翻译、基因沉默和RNA加工等功能。最近的临床研究发现，tRFs在肿瘤患者唾液来源的外泌体中富集，其表达水平与患者生存期密切相关，因较高的准确性和组织特异性具有开发为肿瘤生物标志物的潜能。以往有研究发现tRFs能够与eIF4G竞争性结合靶蛋白的mRNA影响核基因编码蛋白的翻译，因此，进一步研究缺氧诱导的tRFs在mtDNA编码蛋白翻译中的作用可能为靶向线粒体干扰HCC细胞能量代谢提供新思路。
[0005]因此鉴定缺氧条件下HCC细胞衍生的tRFs，分析其在肿瘤侵袭转移中的作用及机制，为拓展分子探针为基础的新型诊疗方案提供新靶标。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于：为了解决肿瘤缺氧微环境却引起了患者放化疗抵抗，甚至复发和转移严重影响了患者的预后的问题，而提出的一种肝细胞癌诊断治疗的应用方法。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
[0008]一种肝细胞癌诊断治疗的应用方法，具体实施方式为：
[0009]S1、分别利用常氧及1％氧气处理肝细胞癌细胞SNU
‑
387，每组设置3个样本进行tRFs测序；
[0010]S101、提取各组样本总RNA，进行纯化后获得1～2μgRNA并采用凝胶电泳进行质量
分析；
[0011]S102、接着进行tRF预处理，去除m1A和m3C去甲基化等RNA修饰防止干扰RNA
‑
seq文库构建；
[0012]S103、将RNA逆转录为cDNA并进行RNA序列文库的制备；
[0013]S104、tRF测序，利用Illumina NextSeq系统开展标准小RNA测序，将序列图谱与参考基因组比对，分析tRFs的差异表达；
[0014]S2、细胞侵袭迁移能力评价，需要进行Transwell实验和划痕实验；
[0015]S201、将细胞铺于24孔板中，取约5
×
104个细胞悬于100μL无血清培养液于上室，加入DMEM培养液于下室；
[0016]S202、将24孔板平稳放入37℃，5％的CO2细胞孵育箱中培养48h，吸弃上室培养液，用PBS缓冲液洗3次Transwell小室中细胞；
[0017]S203、于小室中加多聚甲醛溶液固定细胞，拿出24孔板，针头弃去多余多聚甲醛溶液，晾干；
[0018]S204、每孔加入的结晶紫染色液进行细胞染色，用PBS清洗小室2次，用棉签擦去上室中未穿过的细胞；
[0019]S205、用荧光显微镜明场拍照，计数多个视野中的细胞量；
[0020]S206、显微镜下观察细胞，若细胞长至12孔板的九成以上且状态良好，用1mL的PBS缓冲液清洗细胞2次；
[0021]S207、用10μL枪头在12孔板中间划一道垂直的竖直线，尽量保证力度和角度不变，再用PBS清洗细胞，直至显微镜下划痕区域上没有可见的悬浮细胞；
[0022]S208、显微镜下拍照，此时计为0h，保存图片，将12孔板放入细胞培养箱，分别1mL无血清培养液培养24h和48h后分别拍照，最后应用ImageJ软件对照片进行迁移结果分析；
[0023]S3、线粒体呼吸链功能评价指标；
[0024]S301、利用OCR(oxygen consumption rate)检测细胞氧耗：将细胞以5
×
104个/孔接种于不透光的黑色96孔板中,待细胞融合度为95％于常氧或缺氧条件下培养3h；
[0025]S302、使用连续加样器加入预热的氧敏感探Xtra
‑
Oxygen Consumption Assay缓冲液，向每孔中添加预热的矿物油；
[0026]S303、将准备好的样品放置预热的FLUOstar
‑
ACU中，监测并观察耗氧率的改变；
[0027]S304、利用多功能酶标仪检测细胞ATP生成：充分裂解细胞，4℃12000g5min离心取上清；
[0028]S305、在检测管中加入ATP检测工作液，室温放置消耗本底性的ATP后，加入样品利用多功能酶标仪测定RLU值；
[0029]S4、tRF
‑
3Thr
‑
CGT转染HCC细胞；
[0030]S401、转染前一天将细胞接种于不含抗生素的完全培养基中，使其在转染时融合度到达70％；
[0031]S402、转染前半小时将培养液换为预热后的无血清培养液，并按照转染试剂说明书进行操作；
[0032]S403、在37℃孵箱中培养4
‑
6h后加入含有10％FBS的完全培养基；
[0033]S5、免疫印迹法检测线粒体呼吸链蛋白的表达情况；
[0034]S501、在转染tRF
‑
3Thr
‑
CGT mimic或inhibitor的细胞中加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，超声处理后置于冰上充分裂解30min；
[0035]S502、通过BCA法进行蛋白定量保证各组样品蛋白浓度相同，利用上样缓冲液进行蛋白变性并上样至SDS
‑
PAGE凝胶(10cm
×
10cm)；
[本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肝细胞癌诊断治疗的应用方法，其特征在于，具体实施方式为：S1、分别利用常氧及1％氧气处理肝细胞癌细胞SNU
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387，每组设置3个样本进行tRFs测序；S101、提取各组样本总RNA，进行纯化后获得1～2μgRNA并采用凝胶电泳进行质量分析；S102、接着进行tRF预处理，去除m1A和m3C去甲基化等RNA修饰防止干扰RNA
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seq文库构建；S103、将RNA逆转录为cDNA并进行RNA序列文库的制备；S104、tRF测序，利用Illumina NextSeq系统开展标准小RNA测序，将序列图谱与参考基因组比对，分析tRFs的差异表达；S2、细胞侵袭迁移能力评价，需要进行Transwell实验和划痕实验；S201、将细胞铺于24孔板中，取约5
×
104个细胞悬于100μL无血清培养液于上室，加入DMEM培养液于下室；S202、将24孔板平稳放入37℃，5％的CO2细胞孵育箱中培养48h，吸弃上室培养液，用PBS缓冲液洗3次Transwell小室中细胞；S203、于小室中加多聚甲醛溶液固定细胞，拿出24孔板，针头弃去多余多聚甲醛溶液，晾干；S204、每孔加入的结晶紫染色液进行细胞染色，用PBS清洗小室2次，用棉签擦去上室中未穿过的细胞；S205、用荧光显微镜明场拍照，计数多个视野中的细胞量；S206、显微镜下观察细胞，若细胞长至12孔板的九成以上且状态良好，用1mL的PBS缓冲液清洗细胞2次；S207、用10μL枪头在12孔板中间划一道垂直的竖直线，尽量保证力度和角度不变，再用PBS清洗细胞，直至显微镜下划痕区域上没有可见的悬浮细胞；S208、显微镜下拍照，此时计为0h，保存图片，将12孔板放入细胞培养箱，分别1mL无血清培养液培养24h和48h后分别拍照，最后应用Image J软件对照片进行迁移结果分析；S3、线粒体呼吸链功能评价指标；S301、利用OCR(oxygen consumption rate)检测细胞氧耗：将细胞以5
×
104个/孔接种于不透光的黑色96孔板中,待细胞融合度为95％于常氧或缺氧条件下培养3h；S302、使用连续加样器加入预热的氧敏感探Xtra
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Oxygen Consumption Assay缓冲液，向每孔中添加预热的矿物油；S303、将准备好的样品放置预热的FLUOstar
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ACU中，监测并观察耗氧率的改变；S304、利用多功能酶标仪检测细胞ATP生成：充分裂解细胞，4℃12000g5min离心取上清；S305、在检测管中加入ATP检测工作液，室温放置消耗本底性的ATP后，加入样品利用多功能酶标仪测定RLU值；S4、tRF
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3Thr
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【专利技术属性】
技术研发人员：颜晓羽，曲仙智，苏静，沈璐妍，刘卜菡，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：