一种RNA加帽效率的定量方法、试剂盒及其应用技术

本发明专利技术提供了一种RNA加帽效率的定量方法、试剂盒及其应用。其中，该方法主要包括：对RNA样品进行逆转录，得到所述RNA样品的逆转录产物；对所述逆转录产物进行至少一轮PCR，并对PCR产物进行纯化、测序；基于所述测序结果计算所述RNA样品中的RNA加帽效率。本发明专利技术基于高通量结果可以直接分析出已加帽的RNA序列量的特点，采用高通量测序这一技术手段对RNA加帽效率进行确定，可实现对RNA加帽效率的精准定量。并且，本发明专利技术提供的方法在定量过程中不涉及放射性同位素等高危试剂的使用，不需要色谱、质谱等大型贵重仪器的参与。因此，本发明专利技术提供的方法，在实验室研究和工业生产中均具有广阔的应用前景。应用前景。应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种RNA加帽效率的定量方法、试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于分子生物学和生物化学领域，特别是涉及一种RNA加帽效率的定量方法、试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]在药物治疗领域，RNA作为治疗药物因其副作用更小，已然成为最为热门的药物研究方向之一，具有广泛的应用前景，例如：新型冠状病毒和其他感染性相关疾病疫苗、肿瘤免疫治疗和基因编辑等(E.J.Anderson et al.,2020；Pardi,Hogan,Porter,&Weissman,2018；Sahin et al.,2017)。
[0003]RNA的制备流程主要包括：DNA转录模板线性化、体外转录获得未加帽RNA、RNA5'端加帽修饰和RNA3'端多聚腺苷酸修饰。其中，5'端加帽修饰主要有两种方案，即:与转录同时发生的“共转录加帽”和转录完成后酶修饰加帽。无论哪种加帽方案，其加帽效率都很难达到100％，而未加帽RNA不能起始翻译而表达，在体内不稳定容易降解。因此，基于mRNA治疗的临床前和临床研究中，对mRNA加帽效率的检测评估是mRNA质量控制的重要环节。目前，主要有以下几种加帽效率检测方案：
[0004]1.CN105209633A公布的检测方法为：基于ELSA原理，使用抗m7G的特异性抗体(一抗)与帽结构特异性结合，随后利用二抗与一抗的特异性结合，并检测相应信号(如荧光信号、比色信号)从而测定RNA加帽效率。缺点：本方法需对抗体特异性要求高；本方法是间接的测定加帽效率，标准品不一定能完全模拟真实RNA样本的情况。
[0005]2.CN105051213A公布的方法为：利用DNA寡聚体探针特异性地与目的RNA结合形成DNA
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RNA杂交分子，随后利用一种或多种核酸酶(核酸酶S1、RNA酶H或者其他的5
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核酸外切酶)对目的RNA进行降解，得到目的RNA5
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端区域(不超过5个碱基)，最后通过色谱的方法分析5
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端区域加帽和未加帽的占比。缺点：本方法对探针特异性要求较高；RNA酶H对DNA
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RNA杂交分子的酶切位点特异性不高，最终的产物成分会比较复杂而对定量分析产生干扰导致定量结果可靠性降低；另外该方法需要色谱和质谱等贵重仪器，这也影响其推广应用。
[0006]3.最近报道了一种利用核酶(ribozyme)对RNA进行加帽效率定量分析的方法(Vlatkovic et al.,2022)。该方法利用核酶特异性切割RNA5
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端区域，由于加帽与未加帽RNA的切割产物会相差一个碱基，通过对变性凝胶电泳(尿素
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聚丙烯酰胺凝胶电泳)后RNA条带亮度和大小进行分析，也可对切割产物进行回收纯化后基于LC
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MS的方法进行分析，从而定量计算RNA的加帽效率。缺点：本方法依赖于核酶的特异性切割，高特异性、高效的核酶设计是本方法的关键。针对不同RNA具有的不同5
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端UTR序列,高特异性、高效的核酶设计也许是一个难点。
[0007]由上述可知，本
亟需一种新的定量加帽效率的方法，以解决上述现有技术中存在的缺点，使加帽效率的评估方法同时满足高效、高精度、易操作等优点。

技术实现思路

[0008]为解决上述现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种RNA加帽效率的定量方法、试剂盒及其应用，以使RNA加帽效率的定量同时具有高准确度、易操作的优点。具体内容如下：
[0009]第一方面，本专利技术提供了一种RNA加帽效率的定量方法，所述方法包括：
[0010]对RNA样品进行逆转录，得到所述RNA样品的逆转录产物；
[0011]对所述逆转录产物进行至少一轮PCR，并对PCR产物进行纯化、测序；
[0012]基于所述测序结果计算所述RNA样品中的RNA加帽效率。
[0013]在一些实施例中，所述逆转录的操作包括：在逆转录引物的作用下，对所述RNA样品进行逆转录。
[0014]在一些实施例中，所述对所述逆转录产物进行至少一轮PCR，是指：对所述逆转录产物进行两轮PCR。
[0015]在一些实施例中，所述两轮PCR中的第一轮PCR的操作包括：
[0016]对所述逆转录产物进行稀释；
[0017]配置第一轮PCR体系并通过PCR仪进行第一轮PCR；其中，所述第一轮PCR体系中包含：PCR缓冲液、第一轮PCR引物、DNA聚合酶、无核酸酶水以及稀释后的逆转录产物。
[0018]在一些实施例中，所述两轮PCR中的第二轮PCR的操作包括：
[0019]配置第二轮PCR体系并通过PCR仪进行第二轮PCR；其中，所述第二轮PCR体系中包含：PCR缓冲液、第二轮PCR引物、DNA聚合酶、无核酸酶水以及第一轮PCR产物。
[0020]在一些实施例中，所述纯化采用的方法为：磁珠纯化法、硅膜离心柱纯化法、乙醇沉淀纯化法中的任意一种或多种组合。
[0021]在一些实施例中，所述基于所述测序结果计算所述RNA样品中的RNA加帽效率的具体操作包括：
[0022]以接头序列为筛选依据，从所述测序结果中筛选出含有接头序列的预处理序列；
[0023]以接头序列的末端碱基为提取参考位点，从所述预处理序列中提取所述末端碱基后连续的20～50碱基长度的碱基序列；
[0024]计算所述20～50碱基长度的碱基序列中已加碱基序列的加帽效率。
[0025]第二方面，本专利技术提供了一种检测RNA加帽效率的试剂盒。所述试剂盒用于上述第一方面所述方法；其中，所述试剂盒内置有逆转录酶和反应缓冲液，所述逆转录酶和反应缓冲液用于对RNA样品进行逆转录。
[0026]第三方面，本专利技术提供了一种生产RNA的方法。所述方法包括根据上述第一方面所述定量方法定量RNA加帽效率的步骤。
[0027]第四方面，本专利技术提供了一种根据上述第三方面所述方法生产的RNA。
[0028]第五方面，本专利技术提供了一种上述第一方面所述的方法在RNA生产期间中的应用；或一种上述第一方面所述的方法在RNA作为治疗产品的质量控制中的应用。
[0029]本专利技术提供了一种RNA加帽效率的定量方法、试剂盒及其应用。其中，该方法主要包括：对RNA样品进行逆转录，得到所述RNA样品的逆转录产物；对所述逆转录产物进行至少一轮PCR，并对PCR产物进行纯化、测序；基于所述测序结果计算所述RNA样品中的RNA加帽效率。本专利技术基于高通量结果可以直接分析出已加帽的RNA序列量的特点，采用高通量测序这
一技术手段对RNA加帽效率进行确定，可实现对RNA加帽效率的快速、精准定量。并且，本专利技术提供的方法在定量过程中不涉及如特异性抗体、特异性探针、特异性核酶等特异性助剂的使用，因而避免了高特异性、高效的特异性助剂的设计这一难点，很大程度上降低了操作难度，提高了检测效率。因此，本专利技术提供的方法，在实验室研究和工业生产中均具有广阔本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种RNA加帽效率的定量方法，其特征在于，所述方法包括：对RNA样品进行逆转录，得到所述RNA样品的逆转录产物；对所述逆转录产物进行至少一轮PCR，并对PCR产物进行纯化、测序；基于所述测序结果计算所述RNA样品中的RNA加帽效率。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述逆转录的操作包括：在逆转录引物的作用下，对所述RNA样品进行逆转录。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对所述逆转录产物进行至少一轮PCR，是指：对所述逆转录产物进行两轮PCR。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述两轮PCR中的第一轮PCR的操作包括：对所述逆转录产物进行稀释；配置第一轮PCR体系并通过PCR仪进行第一轮PCR；其中，所述第一轮PCR体系中包含：PCR缓冲液、第一轮PCR引物、DNA聚合酶、无核酸酶水以及稀释后的逆转录产物。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述两轮PCR中的第二轮PCR的操作包括：配置第二轮PCR体系并通过PCR仪进行第二轮PCR；其中，所述第二轮PCR体系中包含：PCR缓冲液、第二轮PCR引物、DNA聚合酶、无核酸酶水以及第一轮PCR产物。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纯化采用的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁平，雷霆钧，刘显霞，
申请(专利权)人：四川康德赛医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：