一种新抗原鉴定和疗效预测方法技术

本发明专利技术公开一种新抗原鉴定和疗效预测方法，先筛选出候选新抗原，然后将候选新抗原与淋巴细胞共同培养，找出淋巴细胞对新抗原有较好反应的新抗原，为有效新抗原，通过分析淋巴细胞的功能和亚型预测靶向新抗原的免疫治疗方案的疗效。该有效新抗原在制备针对肿瘤的治疗性疫苗、预防肿瘤复发疫苗以及治疗肿瘤的免疫细胞疗法有极大的应用前景。本方法能够提升找到有效新抗原的效率，方便应用。本发明专利技术可以快速准确的鉴定肿瘤新抗原，并筛选预测疗效好的新抗原用于制备肿瘤多肽/mRNA疫苗，随后向受试者施用有效剂量的新抗原多肽或mRNA疫苗；体外培养或筛选新抗原特异性T细胞用于新抗原特异性T细胞免疫治疗。特异性T细胞免疫治疗。特异性T细胞免疫治疗。

【技术实现步骤摘要】
一种新抗原鉴定和疗效预测方法


[0001]本专利技术涉及肿瘤新抗原鉴定和靶向肿瘤新抗原的免疫治疗疗效预测
，尤其涉及一种新抗原鉴定和疗效预测方法。

技术介绍

[0002]肿瘤细胞具有异于正常细胞基因组的特征，其中一小部分异常基因组编码的氨基酸序列可以被免疫细胞识别，这部分被免疫细胞识别的氨基酸序列(通常为8
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15个核心氨基酸长度)就是新抗原。新抗原仅存在于肿瘤细胞，而在正常细胞中不存在；靶向新抗原的免疫疗法对正常细胞无杀伤作用，仅特异性识别和杀伤肿瘤细胞，因此在治疗过程无明显毒副作用且疗效显著，是肿瘤免疫治疗最理想的治疗靶标。新抗原是免疫细胞特异性识别肿瘤细胞基础，也是哺乳动物依靠自身免疫系统清除肿瘤细胞的关键所在。
[0003]现有的新抗原鉴定方法通过二代测序将肿瘤细胞异于正常细胞的点突变或异常基因找出来，随后通过免疫学方法鉴定能够引起免疫反应的异常基因编码的新抗原，例如中国专利CN103180730。实际上，能够引起免疫反应的新抗原不足测序检测到异常基因总数量的1％，体内能够对新抗原有反应的免疫细胞数量也不足1％，新抗原的成功鉴定需要更多的检测标志物。现有新抗原的检测的标志物方法容易受免疫细胞非特异性激活的干扰，有假阳性的现象；因为不同新抗原的疗效不同，靶向新抗原的免疫治疗有效性缺少准确性高的预测方案，新抗原鉴定和疗效预测技术都需要改进。
[0004]因此，现有技术存在缺陷，需要改进。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题是：提供一种新抗原鉴定和疗效预测方法，提升对新抗原鉴定和疗效预测的准确性，方便应用。
[0006]本专利技术的技术方案如下：提供一种新抗原鉴定和疗效预测方法，包括以下步骤。
[0007]S1：取肿瘤组织和正常细胞开展全外显子测序和/或转录组测序和/或单细胞转录组测序，确定肿瘤组织异于正常细胞的非同义点突变和突变所在基因表达水平；取外周血或穿刺脾细胞或淋巴结或肿瘤组织浸润性淋巴细胞，使用人淋巴细胞分离液分离获得淋巴细胞，PBS缓冲溶液清洗后用无血清淋巴细胞培养基重悬置，37℃培养箱培养备用。
[0008]S2：以突变位点为中心，向前后各截取X个氨基酸序列，获得候选抗原序列，X为MHC分子类型最大可递呈的核心氨基酸数量；若突变位点距离起始密码子或终止密码子距离小于X个氨基酸时候，向前截取到起始密码子，向后截取到终止密码子；同时，获取候选抗原序列对应的未突变野生型序列。
[0009]S3：根据步骤S2中的获取得候选抗原序列，合成对应的抗原型多肽序列或抗原型mRNA序列或抗原型DNA序列；根据未突变野生型序列，合成野生型多肽序列或野生型mRNA序列或野生型DNA序列。
[0010]S4：将抗原型多肽序列或抗原型mRNA序列或抗原型DNA序列跟步骤S1中获得的淋
巴细胞共同培养1
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6天，为候选抗原组；将野生型多肽序列或野生型mRNA序列或野生型DNA序列跟步骤S1获得的淋巴细胞共培养1
‑
6天，为野生型对照组。
[0011]S5：采用流式抗体标记淋巴细胞CD11b和/或CD83和/或MHC
‑
II和/或CD62L和/或4
‑
1BBL表达情况，候选抗原组中的CD11b和/或CD83和/或MHC
‑
II和/或CD62L和/或4
‑
1BBL表达情况为阳性的细胞数/细胞亚群比例/抗体所带荧光强度/基因表达水平高于野生型对照时，鉴定结果即为阳性，此该候选抗原组种的候选抗原即鉴定为新抗原。
[0012]或者通过Elisa和/或Elispot和/或流式细胞检测术检测野生型对照组和候选抗原组的培养上清的IL
‑
1α细胞因子释放情况，若候选抗原组的IL
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1α细胞因子的表达水平高于野生型组即为阳性，此候选抗原鉴定为新抗原。
[0013]S6：对步骤S5鉴定出的新抗原进行CD25和/或IL7Rα和/或CD44表达检测；新抗原同淋巴细胞共孵育后对比孵育前淋巴细胞，新抗原同淋巴细胞共孵育后的淋巴细胞的CD25和/或IL7Rα、和/或CD44阳性的细胞数/细胞亚群比例/抗体所带荧光强度/基因表达水平比孵育前淋巴细胞没有显著上调，预测步骤S5鉴定的新抗原疗效较好，反之预测为疗效较差。
[0014]或者，通过Elisa或Elispot或流式细胞检测术检测野生型组和新抗原组培养上清的IL12p70细胞因子释放情况，若IL12p70在新抗原组表达水平高于野生型组即为阳性，预测步骤S5鉴定的新抗原疗效较好，反之预测为疗效较差。
[0015]或者，对步骤S5中鉴定的新抗原的基因序列在肿瘤细胞中的表达和新抗原对应正常基因序列在正常细胞表达情况，若新抗原的基因序列在肿瘤细胞的mRNA或蛋白表达水平相较新抗原对应正常基因序列在正常细胞中的表达情况有升高，预测步骤S5鉴定的新抗原疗效较好，反之预测为疗效较差。
[0016]先筛选出候选新抗原，然后将候选新抗原与淋巴细胞共同培养，找出淋巴细胞对新抗原有较好反应的新抗原，新抗原在肿瘤细胞中的表达水平较高时，为有效新抗原，该有效新抗原在制备针对预防肿瘤的疫苗以及治疗肿瘤的药物有极大的应用前景。有针对性的对候选新抗原进行筛选和鉴定，能够提升找到有效新抗原的效率，方便应用。
[0017]进一步地，在步骤S4中，还包括对抗原型多肽序列或抗原型mRNA序列或抗原型DNA序列、野生型多肽序列或野生型mRNA序列或野生型DNA序列进行电击一次，电击的工作电压150V，电击15ms。电击能够使抗原型多肽序列或抗原型mRNA序列或抗原型DNA序列、野生型多肽序列或野生型mRNA序列或野生型DNA序列更高效率的进入抗原递呈细胞。
[0018]进一步地，在步骤S6中，基因序列在细胞的mRNA表达水平采用转录组测序或RT
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Real time PCR检测实现，基因序列在细胞的蛋白表达水平采用蛋白质谱或Western blot检测实现。
[0019]进一步地，用于对哺乳动物的癌症的新抗原进行鉴定和疗预测，哺乳动物的癌症包括但不限于：B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、蕈样真菌病、霍奇金氏病、髓细胞性白血病、膀胱癌、脑癌、神经系统癌症、头颈癌、头颈部鳞状细胞癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、肝癌、口腔、咽喉、喉部和肺的鳞状细胞癌、宫颈癌、乳腺癌、肾癌、泌尿生殖系统癌症、肺癌、食管癌、头颈癌、大肠癌、造血系统癌症；睾丸癌；结直肠癌、前列腺癌、AIDS相关的淋巴瘤或AIDS相关的肉瘤的任意一种。
[0020]进一步地，所述有效新抗原应用于制备包含有有效新抗原的疫苗或新抗原特异性
T细胞。
[0021]进一步地，体外培养或筛选有效新抗原特异性T细胞用于制备新抗原特异性T细胞免疫细胞药物。
[0022]进一步地，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新抗原鉴定和疗效预测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：取肿瘤组织和正常细胞开展全外显子测序和/或转录组测序和/或单细胞转录组测序，确定肿瘤组织异于正常细胞的非同义点突变和突变所在基因表达水平；取外周血或穿刺脾细胞或淋巴结或肿瘤组织浸润性淋巴细胞，使用人淋巴细胞分离液对外周血或穿刺脾细胞或淋巴结分离获得淋巴细胞，PBS缓冲溶液清洗后用无血清淋巴细胞培养基重悬置，37℃培养箱培养备用；S2：以突变位点为中心，向前后各截取X个氨基酸序列，获得候选抗原序列，X为MHC分子类型最大可递呈的核心氨基酸数量；若突变位点距离起始密码子或终止密码子距离小于X个氨基酸时候，向前截取到起始密码子，向后截取到终止密码子；同时，获取候选抗原序列对应的未突变野生型序列；S3：根据步骤S2中的获取得候选抗原序列，合成对应的抗原型多肽序列或抗原型mRNA序列或抗原型DNA序列；根据未突变野生型序列，合成野生型多肽序列或野生型mRNA序列或野生型DNA序列；S4：将抗原型多肽序列或抗原型mRNA序列或抗原型DNA序列跟步骤S1中获得的淋巴细胞共同培养1
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6天，为候选抗原组；将野生型多肽序列或野生型mRNA序列或野生型DNA序列跟步骤S1获得的淋巴细胞共培养1
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6天，为野生型对照组；S5：采用流式抗体标记淋巴细胞CD11b和/或CD83和/或MHC
‑
II和/或CD62L和/或4
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1BBL表达情况，候选抗原组中的CD11b和/或CD83和/或MHC
‑
II和/或CD62L和/或4
‑
1BBL表达情况为阳性的细胞数/细胞亚群比例/抗体所带荧光强度/基因表达水平高于野生型对照时，鉴定结果即为阳性，此该候选抗原组种的候选抗原即鉴定为新抗原；或者通过Elisa和/或Elispot和/或流式细胞检测术检测野生型对照组和候选抗原组的培养上清的IL
‑
1α细胞因子释放情况，若候选抗原组的IL
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1α细胞因子的表达水平高于野生型组即为阳性，此候选抗原鉴定为新抗原；S6：对步骤S5鉴定出的新抗原进行CD25和/或IL7Rα和/或CD44表达检测；新抗原同淋巴细胞共孵育后对比孵育前淋巴细胞，新抗原同淋巴细胞共孵育后的淋巴细胞的CD25和/或IL7Rα、和/或CD44阳性的细胞数/细胞亚群比例/抗体所带荧光强度/基因表达水平比孵育前淋巴细胞没有显著上调，预测步骤S5鉴定的新抗原疗效较好，反之预测为疗效较差；或者，通过Elisa或Elispot或流式细胞检测术检测野生型组和新抗原组培养上清的IL12p70细胞因子释放情况，若IL12p70在新抗原组表达水平高于野...

【专利技术属性】
技术研发人员：王飞，吴松，李宇清，
申请(专利权)人：初源海生物科技深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：