一种优化的二代基因测序合成反应试剂制造技术

本发明专利技术公开了一种优化的二代基因测序合成反应试剂。该合成反应试剂，包括缓冲液、可溶性盐、聚合酶和核苷酸类似物，所述缓冲液选自HEPES缓冲液、SSC缓冲液、Tricine缓冲液、PBS缓冲液中的至少一种。根据本申请的合成反应试剂，至少具有以下有益效果：为了寻找能够在信号采集和合成反应同时进行过程中具有良好保护作用的试剂，对反应的缓冲体系进行了调整，当采用HEPES、SSC、Tricine、磷酸盐等缓冲体系时，相比于现有的Tris对于核酸分子的保护作用以及反应产生荧光的淬灭抑制具有良好效果。以及反应产生荧光的淬灭抑制具有良好效果。以及反应产生荧光的淬灭抑制具有良好效果。

【技术实现步骤摘要】
一种优化的二代基因测序合成反应试剂


[0001]本专利技术属于基因测序领域，具体涉及一种优化的二代基因测序合成反应试剂。

技术介绍

[0002]现有的二代测序技术(sequencing by synthesis，SBS)以Illumina公司的桥式扩增技术以及华大基因的DNBSEQ技术为代表，均以检测荧光信号的方法来实现DNA序列中4种碱基(A、C、G和T/U)的鉴定和区分。具体来说，这些方法使用带荧光基团和阻断基团的dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)，并且dATP、dCTP、dGTP、dTTP分别携带不同的荧光基团。目前基于SBS的测序方法包括以下三个步骤：1、合成反应：在聚合酶作用下，将带有荧光基团以及阻断基团的dNTPs添加到测序合成链的3
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端；2、信号采集：聚合反应结束后，光学成像系统会对采集其荧光信号；3、切除反应：信号采集完成后，会加入合适的切除试剂，将荧光基团以及阻断基团从dNTPs上切下来，使得dNTPs回到天然状态，进入下一个循环。
[0003]受限于目前的光学成像系统和测序试剂的性质，以上三个步骤大多数情况下只能依次进行。对此，有尝试将测序中的聚合反应与信号采集步骤同步进行，不仅缩短了测序循环的时间，还减少了测序试剂盒中试剂的种类，降低了测序成本。但在信号采集过程中，因为缺乏成像缓冲液的保护，荧光信号淬灭的很快，而且整体的测序质量也有较大幅度的下降。为此，有必要对测序合成试剂优化，从而使得荧光信号采集在与合成反应同步进行的情况下，保证测序的整体质量。r/>
技术实现思路

[0004]本申请旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种优化的二代基因测序合成反应试剂，利用该合成反应试剂进行测序的合成步骤，可以保护核酸分子不受或少受损伤，同时抑制荧光信号的淬灭，从而保证整体的测序质量。
[0005]根据本申请的一个方面，提出了一种合成反应试剂，包括缓冲液、可溶性盐、聚合酶和核苷酸类似物，所述缓冲液选自HEPES(4
‑
羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲液、SSC(柠檬酸钠)缓冲液、Tricine(三(羟甲基)甲基甘氨酸)缓冲液、PBS(磷酸盐)缓冲液中的至少一种。
[0006]根据本申请的合成反应试剂，至少具有以下有益效果：
[0007]为了寻找能够在信号采集和合成反应同时进行过程中具有良好保护作用的试剂，对反应的缓冲体系进行了调整，当采用HEPES、SSC、Tricine、磷酸盐等缓冲体系时，相比于现有的Tris对于核酸分子的保护作用以及反应产生荧光的淬灭抑制具有良好效果。
[0008]在本申请的一些实施方式中，缓冲液为HEPES缓冲液、SSC缓冲液中的任一种。上述两种缓冲液体系对于核酸分子的保护以及荧光淬灭的抑制效果最好，相同条件下可以获得更高的测序质量。
[0009]在本申请的一些实施方式中，缓冲液中的缓冲剂的浓度为0.1mM～1000mM，具体的，可以是0.1mM、0.2mM、0.5mM、1mM、2mM、5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、200mM、300mM、400mM、500mM、600mM、700mM、800mM、900mM、1000mM。进一步
的，缓冲剂的浓度为1～500mM，2～300mM，10～200mM，20～100mM。其中，缓冲剂是指缓冲液中起缓冲作用的成分，例如HEPES缓冲液中的缓冲剂即为4
‑
羟乙基哌嗪乙磺酸。
[0010]在本申请的一些实施方式中，合成反应试剂还包括抗氧化剂。采用诸如激光的方式激发荧光基团的荧光时，激光能量可能会对核酸分子产生明显的光损伤和光漂白作用，出于消除激光下产生的单线态氧所带来的强氧化性作用、保护核酸分子的目的，在合成反应试剂中引入抗氧化剂。
[0011]在本申请的一些实施方式中，抗氧化剂选自抗坏血酸、亚硫酸、多酚、Trolox(水溶性维生素E)、甘氨酸、还原型谷胱甘肽(GSH)或其盐中的至少一种。其中，盐类的抗氧化剂包括但不限于抗坏血酸盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、多酚酸盐等。
[0012]在本申请的一些实施方式中，多酚为没食子酸或酯。
[0013]在本申请的一些实施方式中，抗氧化剂选自抗坏血酸盐、没食子酸或其衍生酯(如没食子酸的C1～C18的烷基酯、烯基酯，例如没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、没食子酸丙酯、没食子酸丁酯、没食子酸戊酯
……
没食子酸十六烷基酯、没食子酸十七烷基酯、没食子酸十八烷基酯、没食子酸
‑9‑
十八烯酯、没食子酸
‑
6,9,12
‑
十八三烯酯，儿茶素没食子酸酯、表儿茶精没食子酸酯、没食子儿茶精没食子酸酯、没食子儿茶酚没食子酸酯)、亚硫酸氢盐、Trolox、甘氨酸、还原型谷胱甘肽中的至少一种。
[0014]在本申请的一些实施方式中，抗氧化剂的终浓度为0.1mM～100mM，具体的，可以是0.1mM、0.2mM、0.5mM、1mM、2mM、5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM。进一步的，抗氧化剂的终浓度为0.2mM～80mM，0.5mM～50mM，1～20mM。
[0015]在本申请的一些实施方式中，合成反应试剂还包括聚合酶保护剂。为了保护聚合酶，避免影响合成反应的进行，在合成反应试剂中引入一定量的聚合酶保护剂。
[0016]在本申请的一些实施方式中，聚合酶保护剂选自牛血清白蛋白、海藻糖、甘油、聚乙二醇、明胶、葡萄糖中的至少一种。
[0017]在本申请的一些实施方式中，聚合酶保护剂选自牛血清白蛋白、海藻糖、甘油中的至少一种。
[0018]在本申请的一些实施方式中，聚合酶保护剂的终浓度为0.01mM～100mM，具体的，可以是0.01mM、0.02mM、0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.5mM、1mM、2mM、5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM。进一步的，聚合酶保护剂的终浓度为0.01～50mM。
[0019]在本申请的一些实施方式中，合成反应试剂还包括没食子酸、甘油、抗坏血酸盐、牛血清白蛋白中的至少一种。
[0020]在本申请的一些实施方式中，合成反应试剂还包括没食子酸和甘油。
[0021]在本申请的一些实施方式中，合成反应试剂还包括没食子酸和没食子酸的衍生酯中的至少一种，总的终浓度为1～20mM；1～20％体积分数的甘油。
[0022]在本申请的一些实施方式中，合成反应试剂还包括食子酸和没食子酸的衍生酯中的至少一种，总的终浓度为1～10mM；1～10％体积分数的甘油。
[0023]在本申请的一些实施方式中，合成反应试剂还包括没食子酸和没食子酸的衍生酯中的至少一种，以及抗坏血酸盐。
[0024]在本申请的一些实本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.合成反应试剂，其特征在于，包括缓冲液、可溶性盐、聚合酶和核苷酸类似物，所述缓冲液选自HEPES缓冲液、SSC缓冲液、Tricine缓冲液、PBS缓冲液中的至少一种；优选地，所述缓冲液为HEPES缓冲液、SSC缓冲液中的任一种。2.根据权利要求1所述的合成反应试剂，其特征在于，所述合成反应试剂还包括抗氧化剂；优选地，所述抗氧化剂选自抗坏血酸、亚硫酸、多酚、Trolox、甘氨酸、还原型谷胱甘肽或其盐中的至少一种；优选地，所述多酚为没食子酸或酯；优选地，所述抗氧化剂选自抗坏血酸盐、没食子酸或酯、亚硫酸氢盐、Trolox、甘氨酸、还原型谷胱甘肽中的至少一种。3.根据权利要求1所述的合成反应试剂，其特征在于，所述合成反应试剂还包括聚合酶保护剂；优选地，所述聚合酶保护剂选自牛血清白蛋白、海藻糖、甘油中的至少一种。4.根据权利要求1所述的合成反应试剂，其特征在于，所述合成反应试剂还包括没食子酸、甘油、抗坏血酸盐、牛血清白蛋白中的至少一种；优选地，所述合成反应试剂还包括没食子酸和甘油；优选地，所述合成反应试剂还包括没食子酸和抗坏血酸盐；优选地，所述合成反应试剂还包括牛血清白蛋白和没食子酸；优选地，所述合成反应试剂还包括牛血清白蛋白、没食子酸和抗坏血酸盐。5.根据权利要求1至4任一项所述的合成反应试剂，其特征在于，所述可溶性盐包括铵盐、镁盐和钠盐中的至少一种；优选地，所述铵盐选自硫酸铵、氯化铵中的至少一种；优选地，所述镁盐选自硫酸镁、氯化镁中的至少一种；优选地，所述钠盐为氯化钠。6.测序方法，其特征在于，包括以下步骤：合成：在缓冲液中将核苷酸类似物连接到杂交于待测核酸分子的引物上，连接前或连接后的所述核苷酸类似物修饰有荧光基团和阻断基团，所述缓冲液选自HEPES缓冲...

【专利技术属性】
技术研发人员：张长领，王谷丰，
申请(专利权)人：深圳赛陆医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：